一、大麦黄花叶病毒属成员UTR系统进化树分析及编码蛋白跨膜结构推测（论文文献综述）
王雁翔[1]（2021）在《侵染猕猴桃的负义RNA病毒的鉴定及编码蛋白的互作研究》文中研究表明植物负义RNA（-ssRNA）病毒是危害农作物和园艺植物等的一类重要病毒,已发现植物-ssRNA病毒可通过节肢动物进行传播,引起病害扩展。这类病毒的基因组由一条或多条负单链RNA组成,RNA链的5’和3’末端存在反向互补保守序列,可形成锅饼状的二级结构。病毒粒子具有由病毒结构蛋白和寄主成分组成的外膜结构。随着高通量测序技术在植物病毒鉴定中的广泛应用,已发现的植物负义RNA病毒种类也在不断增加,并明确了某些病毒与植物重要病害相关。中国是猕猴桃起源国,具有丰富的猕猴桃种质资源。本研究在对侵染猕猴桃的-ssRNA病毒进行种类鉴定和分子特性研究基础上,深入分析了3种-ssRNA病毒编码蛋白的亚细胞定位和互作特点,为揭示这些病毒编码蛋白的功能奠定了基础。主要结果如下:（1）通过小RNA（sRNA）测序和PCR扩增,首次从来源于贵州和云南的各1份猕猴桃样品中鉴定到正番茄斑萎病毒属（Orthotospovirus）的2种病毒,即番茄坏死斑伴随病毒猕猴桃分离物（tomato necrotic spot associated virus isolate Ac,TNSa V-Ac）和凤仙花坏死斑病毒猕猴桃分离物（Impatiens necrotic spot virus isolate Ac,INSV-Ac）。TNSa V-Ac和INSV-Ac基因组均由3条RNA链（L,M和S）组成。TNSa V-Ac的L、M和S链的大小分别为8908、4772和2991个核苷酸（nucleotide,nt）,INSV-Ac的L、M和S链的长度分别为8776、4969和2991个核苷酸。TNSa V-Ac与番茄坏死斑伴随病毒番茄分离物TNSa V-GZT编码蛋白的氨基酸序列相似性为98.5%-100%。INSV-Ac与凤仙花坏死斑病毒叶椒草分离物INSV-Pepe编码蛋白的氨基酸序列相似性为99.5%-100%。（2）采用欧洲花楸环斑病毒属（Emaravirus）病毒基因组RNA链末端引物5H/3C和RNA1简并引物AF/CR,从来源于浙江的表现出斑驳和褪绿斑的毛花猕猴桃样品上鉴定到该属的一种新病毒,为侵染猕猴桃的Emaravirus属的第二种病毒,命名为猕猴桃欧洲花楸环斑病毒2（Actinidia emaravirus 2,Ac EV-2）。该病毒的基因组由6条RNA链组成,分别为7079 nt、2252 nt、1387 nt、1514 nt、1744nt和1233 nt,编码复制酶（P1）、糖蛋白前体（P2）、核衣壳蛋白（P3）、运动蛋白（P4）、P5蛋白和P6蛋白。糖蛋白前体被酶切Gn和Gc。P1-P4的氨基序列与无花果花叶病毒（fig mosaic virus,FMV）和木豆不育花叶病毒2（pigeonpea sterility mosaic virus 2,PPSMV-2）的相应蛋白的氨基酸序列相似性较高,为62.2%-77.3%。Ac EV-2的P5和P6蛋白与PPSMV-2编码的P5和P6蛋白具有一定的序列相似性,分别为44.2%和39.2%;与FMV和PPSMV-2的系统进化关系较近,而与本研究室前期鉴定的猕猴桃褪绿环斑伴随病毒（Actinidia chlorotic ringspots associated virus,Ac CRa V）的遗传距离较远。采用RT-PCR方法,对来自5个省份（直辖市）的136份猕猴桃样品进行了Ac EV-2检测,28份样品为Ac EV-2阳性,但尚不能确定该病毒与病害之间的关系。（3）采用农杆菌介导的本氏烟瞬时表达系统,比较分析了Ac CRa V编码的Gn、Gc、P3、P4和P5及Ac EV-2的Gn、Gc、P3、P4、P5和P6亚细胞定位特点,发现两种病毒编码的P3均在胞质中形成内含体,P4（运动蛋白）均定位于胞间连丝,两种病毒的其它蛋白亚细胞定位特点不同。采用双分子荧光互补（bimolecular fluorescent complimentary,Bi FC）试验发现,Ac CRa V编码的非保守蛋白P5可招募该病毒的Gn、Gc、P3和P4到近细胞核的胞质,形成类似复制复合体（viral replication complexes,VRCs）的聚集体,推测Ac CRa V的P5通过与这些蛋白互作,参与到病毒的复制、包装和运动过程。Ac EV-2的非保守蛋白P5和P6均与Gc和P4在胞质和细胞核内发生互作,可能与病毒粒子包装和运动有关。（4）对本研究室前期获得的6份猕猴桃样本的高通量测序数据进行了重新分析,鉴定到质型弹状病毒属（Cytorhabdovirus）的一种新病毒,命名为猕猴桃病毒D（Actinidia virus D,Ac VD）。Ac VD基因组的长度为13,589 nt,互补链包含7个ORF,自3’至5’末端分别编码核衣壳蛋白（nucleocapsid protein,N）、磷蛋白（phosphoprotein,P）、P3、基质蛋白（matrix protein,M）、糖蛋白（glycoprotein,G）、P6和复制酶（RNA dependent RNA polymerase,L）,3’和5’非翻译区分别为159 nt和354 nt,各ORF被高度保守的间隔区分隔开。Ac VD与已报道的质型弹状病毒基因组RNA的核苷酸序列相似性为44.6%–51.5%,编码蛋白的氨基酸序列的最高相似性为27.3%（P6）-44.5%（L）,与质型弹状病毒属病毒系统进化关系较近。明确了Ac VD编码的蛋白（N、P、P3、M、G和P6）的亚细胞定位及互作特点,其中M蛋白定位于细胞的微管上,为首次发现弹状病毒的M蛋白具有该定位特点;蛋白N、P和M均可自身互作;蛋白N与P和P3互作,并在胞质形成病毒复制复合体,为质型弹状病毒的重要特点;M蛋白改变了蛋白N、P、P3和G的位置,使其定位到微管上;还发现5个蛋白在核内互作。Ac VD是首个侵染猕猴桃的质型弹状病毒,为更加深入地了解质型弹状病毒蛋白功能提供了信息。
贾文茜[2]（2021）在《黑尾叶蝉感染水稻矮缩病毒后唾液腺转录组变化分析及其两种RNA病毒基因组结构分析》文中研究表明病毒普遍存在于生物体中,极具生态和基因组多样性。昆虫作为地球上已知数量和种类最为丰富的生物类群,是多种病毒的寄主,也是虫媒病毒的重要介体。而相较于已知昆虫和潜在的病毒数量,目前对昆虫病毒的了解还远远不足。近些年来,测序技术的发展加速了昆虫病毒的发现与鉴定,使越来越多的病毒从无症状感染的昆虫宿主中被鉴定出来。黑尾叶蝉Nephotettix cincticeps是亚洲地区常见的水稻害虫,可以传播多种水稻病毒,如水稻矮缩病毒（rice dwarf virus,RDV）。为探究黑尾叶蝉与RDV的关系,本研究在黑尾叶蝉RDV感毒与未感毒唾液腺转录组分析基础上,选择了差异表达的ML（MD-2-related lipid-recognition）基因,并在载量变化较大的病毒中各选取了一种正链和负链RNA病毒进行了系列研究。主要研究结果如下:1.黑尾叶蝉RDV感毒与未感染唾液腺转录组比较分析通过对RDV感毒与未感毒的黑尾叶蝉唾液腺进行转录组比较分析,发现在感染RDV后共有622个差异表达的基因,其中342个基因表达上调,280个基因下调,对差异基因进行富集分析。选择82个差异基因进行验证,其中52个昆虫基因和10个病毒相关序列通过定量PCR得到确认。相关病毒序列c12476g1、c13775g1、c31720g1和c84382g1在感染RDV后表达水平上升,c31757g1、c44831g1、c53292g1、c57866g1、c57866g2和c18405g1表达下降。2.黑尾叶蝉ML基因鉴定及ML蛋白与RDV互作检验对黑尾叶蝉的ML基因进行鉴定,共发现6个ML基因。选择NcML1、NcML2和NcML6基因进行多序列比对和系统进化树分析,并对其编码的蛋白序列进行三级结构建模。使用q PCR对3个NcML基因在不同组织、不同时期的表达模式进行检测,发现在脑中NcML最为丰富,尤其是NcML6基因。使用酵母双杂交、Pull-Down分别验证NcML1、NcML2和NcML6蛋白是否与RDV病毒蛋白互作,结果显示NcML6蛋白与RDV的Pns6、P8和Pns12蛋白互作结果呈阳性。为了解NcML6基因潜在的功能,对黑尾叶蝉进行RNA干扰。NcML6基因干扰效果良好,但并未引发任何症状。3.一种新型黑尾叶蝉iflavirus病毒基因组结构与传播模式研究对Nephotettix cincticeps positive-stranded RNA virus-1（NcPSRV-1）病毒基因组序列做进一步确认和分析。该病毒基因组长10,524核苷酸（nucleotide,nt）,不计入poly（A）尾,包含一个大的开放阅读框（open reading frame,ORF）,该ORF编码一个含3,192个氨基酸（amino acid,aa）的多聚蛋白（polyprotein）。在ORF两侧为5’和3’非编码区（untranslated regions,UTR）。病毒NcPSRV-1具有典型的iflavirus基因组结构,在进化树分析中与Iflaviridae病毒科成员聚类在一起。NcPSRV-1在黑尾叶蝉种群中可进行水平传播和垂直传播。在实验室种群中NcPSRV-1的感染率和病毒载量（viral load）随时间不断增加,维持在较高水平。NcPSRV-1可以侵染黑尾叶近缘种二条黑尾叶蝉N.apicalis,以及黑尾叶蝉的寄生蝇黄足头蝇Pipunculus multillatus,目前尚未有证据显示可以侵染电光叶蝉Recilia dorsalis和水稻Oryza sativa variety TN1。持续RDV感染可改变实验室种群NcPSRV-1的感染率和病毒载量,对NcPSRV-1的增殖抑或传播有一定的拮抗作用。而高NcPSRV-1带毒量的黑尾叶蝉其RDV感毒和传毒的能力逊于NcPSRV-1阴性叶蝉。4.一种新型黑尾叶蝉rhabdovirus病毒基因组结构与进化分析对病毒Nephotettix cincticeps negative-stranded RNA virus-1（NcNSRV-1）基因组序列做进一步确认,获得全长12,361 nt,两端为非编码的3’leader和5’trailer。病毒反义正链的基因组包含5个主要的结构蛋白基因,依次为N、P、M、G和L,是典型的Rhabdoviridae病毒科基因组结构。在G和L基因间,有一个additional gene,命名为P6,该基因具有独立的转录单元,编码一个功能未知的蛋白。系统进化上,NcNSRV-1与昆虫中发现的未分类rhabdovirus病毒聚集在一起,且与其他rhabdovirus病毒在蛋白序列一致性上并不高。转录调节序列一般较为保守,而NcNSRV-1病毒中发现的转录起始序列不同于已分类的rhabdovirus病毒。考虑到进化关系、序列一致性和基因组结构,NcNSRV-1较有可能是昆虫rhabdovirus病毒。目前NcNSRV-1病毒未能在实验室种群中长期维持,可能与宿主或传播途径的缺失有关。
张天则[3]（2021）在《基于RNA-seq的水稻新病毒RCDaV的鉴定及水稻响应RBSDV侵染的lncRNA-mRNA调控网络研究》文中指出水稻是我国最重要的粮食作物,在农业生产中占有重要的地位。水稻病毒病长期以来严重威胁水稻生产。鉴定发现水稻新病毒,研究水稻寄主响应病毒侵染的防卫机制,对保障水稻安全生产具有重要意义。为此,本论文基于高通量测序技术在水稻中鉴定到一个全新的小RNA病毒（picornavirus）,并进一步分析了该新病毒蛋白酶的功能及其切割位点和病毒的进化关系;另一方面,分析了水稻黑条矮缩病毒侵染水稻内长非编码RNA（long non-codingRNA,lncRNA）的转录调控变化情况,研究了病毒侵染下水稻lncRNA-mRNA的调控网络,取得如下研究结果:1.水稻卷曲矮缩相关病毒的鉴定及其编码蛋白酶的功能通过RNA-seq和生物信息学分析,在表现矮化、卷曲症状的水稻植株中发现了一种全新的小RNA病毒,命名为水稻卷曲矮缩相关病毒（rice curl dwarf-associated virus,RCDaV）。RCDaV基因组为一条8,987 nucleotide（nt）的正单链RNA,其3’末端有poly（A）尾巴,基因组编码两个多聚蛋白。利用蛋白酶体外切割实验鉴定了RCDaV 3C蛋白酶（3Cpro）的顺式和反式切割活性,发现RCDaV的两个多聚蛋白经3Cpro的切割加工可产生12个成熟蛋白,并确定了3Cpro的顺式和反式切割位点。值得注意的是,我们发现RCDaV 3Cpro切割的氨基酸位点具有较高保守性,为EPT/S,这完全不同于之前报道其他小RNA病毒3Cpro以Q（E）/G（S）二肽作为切割位点。该发现揭示了RCDaV 3Cpro可能是一种新型的病毒编码的丝氨酸蛋白酶。系统进化树分析发现RCDaV和7个未分类的小RNA病毒在小RNA病毒目（Picornavirales）下聚成一个新支,且这些病毒均编码核心motif为Gx SG的、切割位点为保守的EPT/S的3Cpro蛋白酶。根据系统进化树分析结果、相似的基因组结构、与现有7个小RNA病毒科病毒较低的蛋白同源性、编码新的3C蛋白酶以及保守的EPT/S切割位点,我们建议在小RNA病毒目下建立新的病毒科并将RCDaV和这7个未分类小RNA病毒归于其中。2.水稻响应水稻黑条矮缩病毒侵染的lncRNA-mRNA调控网络植物基因组可以转录产生lncRNA,其中一些已被确定为基因表达的重要调控因子。为了更好地了解水稻植株对水稻黑条矮缩病毒（rice black-streaked dwarf-associated virus,RBSDV）侵染的响应机制,解析RBSDV侵染后lncRNA-mRNA的调控网络,对感染RBSDV和健康水稻植株进行了转录组测序和转录本表达比较分析。结果显示水稻中共有1,342个mRNA和22个lncRNA在RBSDV侵染后存在差异表达,并依此进一步构建了差异表达的lncRNA（differentially expressed lncRNA,DElncRNA）与差异表达的mRNA（differentially expressed mRNA,DEmRNA）的关联网络。转录组结果发现,大部分参与植物-病原体互作途径的差异表达基因在RBSDV侵染后上调表达,表明RBSDV侵染激活了水稻的防御反应。其中,56个植物-病原体互作途径相关的DEmRNA与20个DElncRNA存在共表达关系,表明这些DElncRNA和DEmRNA在水稻响应RBSDV侵染的防卫反应中发挥重要作用。为了验证预测出的DElncRNA-DEmRNA的调控关系,本研究还建立了一种利用水稻愈伤组织快速有效地验证lncRNA-mRNA调控关系的新方法,并选取了3个DElncRNA和7个预测相关的DEmRNA作为研究对象。结果发现有4个DEmRNA受这3个DElncRNA调控,从而为揭示水稻与RBSDV的分子互作机制提供新的研究思路和手段。
韩晓蕾[4]（2021）在《酵母双杂交筛选与小麦黄花叶病毒P2互作的寄主因子及其功能研究》文中研究表明小麦黄花叶病毒（Wheat yellow mosaic virus,WYMV）隶属马铃薯Y病毒科（Potyviridae）,大麦黄花叶病毒属（Bymovirus）。该病毒基因组是由两条正义单链RNA1和RNA2构成,共编码10个蛋白。前期研究表明,WYMV编码的P2在病毒侵染过程中发挥重要功能。然而,P2与寄主因子的互作还没有报道过。本研究首先构建小麦cDNA酵母文库。通过共转试验共筛选获得若干个候选互作寄主因子,包括水杨酸信号通路因子、E3泛素化连接酶、防御反应、氧化还原酶活性、光系统II组件等18种蛋白。根据本研究结果,推测WYMV-P2与寄主候选因子为小麦的E3泛素化类转录因子、水杨酸信号转录因子、植物光系统的稳定组件及叶绿体的形成关键因子等。随后利用一系列互作手段验证证明P2与候选因子TaTIFY10b及其烟草同源基因NbTIFY10A存在互作关系。最后,利用病毒介导基因沉默（VIGS）实验,证实TaTIFY10b/NbTIFY10A参与了寄主对病毒抗病作用。主要的研究结果如下:1.利用GATE-WAY克隆技术,成功地构建小麦cDNA酵母文库。通过酵母双杂实验,将P2-p GBKT7设置为诱饵蛋白并对其小麦cDNA酵母文库进行筛库,共筛选到18个与P2蛋白相互作用的候选寄主因子。2.利用生物信息学鉴定得到候选靶标TaTIFY10b在本氏烟中的同源蛋白为NbTIFY10A,利用酵母双杂交,双分子荧光实验（Bi FC）,GST-Pull down,活体成像等实验证明P2与NbTIFY10A/TaTIFY10b均存在互作关系。3.运用VIGS技术在寄主体内成功沉默该基因,q RT-PCR结果显示在沉默TaTIFY10b对病毒起到正向调控的作用,而NbTIFY10A在本氏烟中起到负调控作用。综上所述,WYMV-P2与NbTIFY10A/TaTIFY10b存在互作,并参与了寄主与病毒的互作过程。
韩晓蕾,高仕祺,张帆,羊健,刘芃,姜鸿明,李林志[5]（2021）在《酵母双杂交筛选与小麦黄花叶病毒P2互作的寄主因子》文中研究指明小麦黄花叶病毒（wheat yellow mosaic virus, WYMV）隶属马铃薯Y病毒科（Potyviridae）,大麦黄花叶病毒属（Bymovirus）。该病毒基因组是由两条正义单链RNA1和RNA2构成,共编码10个蛋白,其编码的P2在病毒的复制过程中发挥重要功能。文章构建了小麦cDNA酵母文库,通过共转试验共筛选获得若干个候选互作寄主因子,包括水杨酸信号通路因子、E3泛素化连接酶、防御反应、氧化还原酶活性、光系统II组件等18种蛋白,研究P2与寄主因子的互作。进一步试验证实,其中的TaTIFY 10A、Ta14-3-3与WYMV-P2存在互作关系。结果表明,WYMV-P2与小麦的E3泛素化类转录因子、水杨酸信号转录因子、植物光系统的稳定组件及叶绿体的形成关键因子等可能存在互作关系,P2可能参与了寄主多种信号途径,为明确WYMV与寄主的互作机制提供了研究基础。
高知枭[6]（2020）在《SsNSRV-1基因功能及其与核盘菌互作机制研究》文中指出核盘菌是一种典型的死体营养型植物病原真菌,在世界范围都有广泛分布,可侵染包括油菜、大豆、向日葵等重要经济作物在内的729种植物,造成严重的经济损失。真菌病毒是感染真菌的病毒,在核盘菌中广泛存在,其中一些真菌病毒会导致核盘菌致病力衰退,甚至丧失致病力,具有控制作物菌核病的潜力。实验室前期从弱毒菌株AH98中分离鉴定出与核盘菌致病力衰退相关的单股负链RNA病毒Sclerotinia sclerotiorum negative-stranded RNA virus 1（Ss NSRV-1）,研究表明该病毒基因组上线性分布有6个非重叠的ORF（ORF I-VI）,分别编码P1、P2（N蛋白）、P3、P4、P5（L蛋白）和P6蛋白,这些ORF的具体功能及其对核盘菌的影响并不清楚;同时,发现菌株AH98可能被多种病毒复合侵染,但并不明确这些病毒的分子特性。本研究以菌株AH98及前期获得的Ss NSRV-1基因ORF I、ORF II、ORF III、ORF IV和ORF VI的核盘菌1980菌株超表达转化子为研究材料,通过高通量测序明确了菌株AH98携带的病毒种类及分子特性;基于生物信息学分析预测了Ss NSRV-1各个ORF的结构和功能;结合转录组和代谢组分析,揭示了Ss NSRV-1各个ORF对核盘菌的影响,初步探究了Ss NSRV-1导致核盘菌出现弱毒特性的分子机理,揭示了Ss NSRV-1与核盘菌互作的分子网络。取得的具体研究结果如下:通过高通量测序明确了菌株AH98中携带6种真菌病毒,包括2种-ss RNA病毒,即Ss NSRV-1与Ss NSRV-5X;4种+ss RNA病毒,分别命名为Bc HV1/AH98、Ss MV30/AH98、Ss MV7-A/AH98和Ss DFV2/AH98。Ss NSRV-5X全长为9993 nt,5’端没有帽子结构,3’端也没有poly A序列,5’-UTR为420 nt,3’-UTR为168 nt。预测编码4个不重叠的ORF（ORF I-ORF VI）,在基因组上线性排列。其中,ORF III最大（nt 2672-8553）,编码的L蛋白含有1952个氨基酸（AA）,含有Mononegaviruses中非常保守的Mononeg＿m RNA＿pol及Mononeg＿m RNAcap结构域。序列分析和系统发育分析表明Ss NSRV-5X属于Mymonaviridae科病毒,但序列特征又与该科现有的病毒有所差异,其L蛋白与Ss NSRV-1的相比,一致性只有17.96%,属于真菌单股负义链RNA病毒科中的一个新的成员,它与另外一种还未报道的病毒（Bc NSRV-7）可能代表一个新的属。Bc HV1/AH98长度为10223 bp,编码的Rd Rp与Bc HV1（Nc＿037659.1）的Rd Rp序列（QBA69887.1）Query Cover达到100%,一致性高达98.82%。系统发育分析表明Bc HV1/AH98应当归类为Hypoviridae科Betahypovirus属,与已报道的Bc HV1（NC＿037659.1）属于同一种病毒的不同株系。实验室前期研究中,发现ORF I、ORF II和ORF III超表达转化子转录的m RNA均发生了不同程度的剪切;而超表达ORF IV和ORF VI的转化子中,病毒基因正常表达,不被剪切。本研究采用宏转录组测序分析进一步确认了这种现象,并发现剪切的起始位点富含GT（GC）,终止位点富含AG,属于真核生物内含子剪切位点的特征序列。而且发现ORF III在禾谷镰孢菌和稻瘟菌中超表达,其转录产物也可以被被剪切;表明真菌可以特异性识别病毒的某些基因,而且这种识别和剪切在真菌中可能普遍存在,可能是一种抗病毒机制。另外,ORF II在AH98和超表达转化子中均具有两个符合正态分布的转录峰,但是与前期检测到N蛋白的两种形式（P41和P43）并不对应,表明ORF II可能还编码其他蛋白。利用生物信息学软件分析了Ss NSRV-1中5个ORF所编码蛋白的保守结构域、亚细胞定位、结构特征及其可能的互作位点;并利用转录组测序技术对病毒5个ORF超表达转化子的总RNA分别进行了宏转录组测序,初步分析了病毒各ORF对核盘菌的影响,并根据这些结果推测病毒基因在Ss NSRV-1与核盘菌互作过程中的功能,推定出Ss NSRV-1导致核盘菌出现弱毒特性的分子机理。发现病毒ORF I编码的蛋白P1具有负链病毒N蛋白的结构特征,与核蛋白同源的可能性高达82.52%,参与Ss NSRV-1病毒粒子的形成,起转录调控的作用。ORF I的超量表达影响了寄主部分与致病、转录、跨膜运输、蛋白质生物合成及修饰、代谢过程等相关基因的表达,导致转化子的生长速度和致病力降低。病毒ORF II编码Ss NSRV-1的N蛋白,主要影响了核糖体和细胞核相关基因的表达,调控了寄主与致病、转录、跨膜运输、代谢过程等相关基因的表达,可能使转化子的生长速度和致病力降低。病毒ORF III编码的P3蛋白在结构上与负链病毒糖蛋白具有一定的同源性,可能具有肽链内切酶的活性,主要影响了核盘菌核糖体、蛋白酶体及DNA复制和修复相关基因的表达,并调控了蛋白质的翻译和代谢过程。病毒ORF IV编码的P4蛋白在寄主体内起转录调控的作用,主要影响了核盘菌与转录调控、氧化还原、跨膜运输、代谢过程等相关基因的表达,通过调控线粒体、r RNA及核糖体相关基因严重影响了能量和代谢过程,可能通过这些方式使得ORF IV超表达转化子表现衰退特性。ORF VI编码的P6蛋白可能是核孔蛋白复合物,参与核质转运过程,同时还可能作为转录调控因子发挥重要的作用。ORF VI的超量表达主要影响了核盘菌与转录调控、跨膜运输、代谢过程等相关的基因的表达,可以部分调控核盘菌与r RNA相关及核糖体相关的基因,严重影响了碳水化合物和核苷酸代谢过程。本研究通过代谢组分析了Ss NSRV-1的ORF I、ORF II、ORF III、ORF IV和ORF VI在核盘菌1980中超表达后核盘菌产生的差异代谢物,并初步鉴定了病毒各ORF导致核盘菌变化最显着的物质,分析了这些物质可能参与的途径。结果表明ORF I、ORF II和ORF III的表达（在核盘菌中超表达后被剪切）对核盘菌代谢影响较大,产生的差异代谢物有较大的相似性,超表达后核盘菌的标志代谢物为酮类物质（显着下调）和酰胺类物质（显着上调）;ORF IV和ORF VI对核盘菌代谢影响影响相对较少,ORF IV超表达后核盘菌的标志代谢物为酰胺类和磷脂类物质（显着下调）,ORF VI超表达后核盘菌的标志代谢物为磷脂类物质（显着上调）。病毒的ORF I、ORF II和ORF III超表达后核盘菌中共有差异代谢物有253个,主要参与苯丙氨酸代谢、不饱和脂肪酸的生物合成、核黄素代谢、磷酸戊糖途径、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成、类固醇生物合成和色氨酸代谢等途径。病毒的ORF IV超表达后有76个差异代谢物,参与甾醇类物质生物合成,半胱氨酸生物合成/同型半胱氨酸降解（反式硫化）等途径。病毒ORF VI超表达后核盘菌有50个差异代谢物,参与多巴胺降解、生物素羧基载体蛋白组装、脂肪酸生物合成起始、尿嘧啶降解和棕榈酸生物合成等通路。本研究发现菌株AH98中除感染Ss NSRV-1之外,还感染了5种病毒,其中Ss NSRV-5X可能代表真菌单股负链RNA病毒科一个新的属;发现在转病毒基因转化子中核盘菌利用内含子剪切机制对病毒基因的m RNA进行剪切,预示真菌中存在一种未知的抗病毒机制。同时,利用生物信息学分析预测了Ss NSRV-1各个ORF的结构和功能,并结合转录组和代谢组分析从整体水平解析了Ss NSRV-1导致核盘菌弱毒的机制。上述结果为研究负链RNA病毒多样性,单股负义链RNA病毒与寄主互作及菌核病控制提供了新的思路和材料。
穆凡[7]（2020）在《澳大利亚核盘菌病毒多样性及低毒菌株SX276中RNA病毒分子特性研究》文中进行了进一步梳理核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）是一种世界性的死体营养型植物病原真菌,可侵染700多种植物,每年造成严重的经济损失。真菌病毒是一类在真菌中复制和增殖的病毒,在核盘菌中普遍存在。部分真菌病毒侵染可以引致核盘菌致病力衰退,具有绿色防控菌核病的潜力。探究核盘菌群体及单个菌株中真菌病毒多样性,发现、鉴定新病毒,不仅为菌核病防控提供生防资源,也为丰富病毒圈进化的证据提供生物材料。本论文分析了来自澳大利亚的核盘菌中真菌病毒种类及多样性,并对低毒菌株SX276中携带的9种真菌病毒进行分子特性及其对核盘菌影响进行了探究。主要研究结果如下:以来自于澳大利亚16种作物上的84株核盘菌菌株为材料,首次对澳大利亚的核盘菌中病毒多样性进行了分析。生物学特性分析发现84株菌株间在菌落形态和致病力等方面均呈现出明显的分化,其中11株菌株表现出低毒特性。采用宏病毒组测序技术分析核盘菌菌株中的病毒种类。在84株核盘菌中,共测序获得285条与病毒相关contig,代表57种不同真菌病毒的基因组部分序列。基于基因组核酸类型划分,75%为正单链RNA（+ss RNA）病毒,14%为双链RNA（ds RNA）病毒,9%为单股负义链RNA（-ss RNA）病毒,及一个DNA病毒。在+ss RNA真菌病毒中,共发现了25种线粒体病毒,占58%。57种病毒隶属于13个不同的病毒科或属中,包括双分病毒科（4%）、减病毒科（5%）、内源病毒科（11%）、线粒体病毒科（44%）、灰葡萄孢欧尔密病毒科（4%）、芜菁花叶病毒科（7%）、丁型线性病毒科（2%）真菌单股负义链RNA病毒科（14%）、全病毒科（2%）、番茄丛矮病毒科（4%）、真菌多聚病毒科（2%）、葡萄孢双节段病毒属（2%）及真菌DNA病毒科（2%）。基于多重比对及遗传进化分析,57种真菌病毒中有60%（34/57）的新病毒。该发现丰富了现有的病毒资源库,增加了我们对病毒多样性,生态学和进化的整体认知。核盘菌菌株SX276是被9种真菌病毒复合侵染的低毒力菌株。菌株SX276菌落形态异常,产生少而小的菌核,菌丝尖端明显弯曲且分枝增多,对油菜致病力弱,是一株典型的低毒菌株。宏转录组测序的技术及数据组装分析,确定菌株SX276携带有9种不同的真菌病毒,包括7种+ss RNA病毒,1种-ss RNA病毒和1种ds RNA病毒。采用RACE等策略,获得了9种真菌病毒的全长基因组序列。基于基因组序列分析,8种真菌病毒隶属于6个病毒科（减病毒科、内源RNA病毒科、芜菁花叶病毒科、丁型线性病毒科、灰葡萄孢欧尔密病毒科、弹状病毒科）、1个病毒属（灰葡萄孢双节段病毒属）及1种分类地位未确定的病毒,表明菌株SX276中真菌病毒种类复杂。核盘菌丁型线性病毒3（Sclerotinia sclerotiorum deltaflexivirus 3,Ss DFV3）为丁型线性病毒科的一个新成员,但与已发现的芜菁花叶病毒目病毒在基因组结构上显着不同,Ss DFV3基因组有三个RNA组分,编码两个隶属于同一超家族的解旋酶基因,且位于Ss DFV3不同RNA组分上,是首次发现的多节段丁型线性病毒。核盘菌真菌阿尔法病毒1（Sclerotinia sclerotiorum mycoalphavirus virus 1,Ss MAV1）是一个未分类的+ss RNA病毒,其基因组仅有一条RNA片段;虽然在真菌中发现了与Ss MAV1亲缘关系较近的真菌病毒,但显着区别于已知病毒,Ss MAV1基因组编码两个解旋酶结构域,推测该病毒在进化过程中发生了解旋酶基因加倍事件。通过病毒粒子和核酸转染方法分析菌株SX276中欧尔密病毒、灰葡萄孢双节段病毒及减病毒对核盘菌的影响。SX276中两种核盘菌欧尔密病毒的ds RNA或/和ss RNA具有侵染能力,但不影响核盘菌基本生物学表型,灰葡萄孢双节段病毒是潜伏侵染,而减病毒与核盘菌低毒相关。真菌中首次发现弹状病毒。核盘菌弹状病毒1（Sclerotinia sclerotiorum rhabdovirus 1,Ss Rh V1）基因组全长含11356 nt,其5?末端与3?末端反向互补。Ss Rh V1基因组（3?-5?）有5个开放阅读框（ORFⅠ-Ⅴ）,推定编码5个蛋白。通过与已知弹状病毒多重比对分析,推定ORFⅠ、ORFⅣ和ORFⅤ分别编码核衣壳蛋白（N）、糖蛋白（G）和复制酶相关蛋白（L）,ORFⅡ与ORFⅢ在NCBI数据库中未比对到任何保守的信息,编码未知功能的假定蛋白。Ss Rh V1基因组中有保守的转录起始信号及转录终止信号,但是未发现保守的转录间隔区。Ss Rh V1的L蛋白与水泡病毒属中皮理病毒（Piry virus）有35%的一致性,N和G蛋白也与其他弹状病毒有较低同源性（最高一致性为29%和25%）。系统进化分析表明Ss Rh V1与已知的20个弹状病毒属未聚在一起,而是单独成一个进化分支,表明Ss Rh V1为弹状病毒科的一个新的成员。Ss Rh V1寄主是真菌,且其与已知弹状病毒同源性低,以及基因组结构等特性,建议以Ss Rh V1为模式种,成立一个新的属:核盘菌弹状病毒属（Sclerorhabdovirus）。Ss Rh V1会削弱核盘菌的生长速度,但不影响核盘菌的致病力。核盘菌内源RNA病毒3（Sclerotinia sclerotiorum endornavirus 3,Ss EV3）与核盘菌低毒力相关,是菌株SX276的低毒因子。Ss EV3基因组全长为12631 nt,编码一个多聚蛋白,包含甲基转移酶（Mtr）、解旋酶（Hel）、依赖RNA的RNA聚合酶（Rd Rp）及S7保守结构域。系统发育分析表明Ss EV3与乙型内源RNA病毒属的成员聚为一进化簇,为该属的一个新成员。通过原生质体脱除真菌病毒以及真菌病毒水平传播研究,发现Ss EV3与核盘菌低毒紧密相关,是菌株SX276的主要低毒因子。Ss EV3的侵染引起核盘菌生长速度减慢,菌落形态异常,产菌核能力下降且致病力降低,呈现低毒特性;也能导致菌株抵抗不良非生物环境,包括高盐、高糖及高渗的能力变弱;产酸性物质能力下降,且不能降解酸性物质,在植物表面不能形成侵染垫。本研究对分离自澳大利亚的核盘菌群体及单个低毒菌株的病毒多样性进行研究,发现、鉴定了41种新的真菌病毒,首次在真菌中发现弹状病毒和多节段丁型线性病毒,并明确了内源RNA病毒是菌株SX276的主要的低毒因子,不仅丰富了真菌病毒的种类,为植物病害的生物防治提供了潜在的真菌病毒资源,也为研究病毒进化、生态学提供丰富的生物材料。
吴会杰[8]（2019）在《SLCCNV和MNSV侵染性克隆的构建及致病因子鉴定》文中认为甜瓜（Cucumis melo）是我国重要的经济作物之一。近年来,新突发病毒病严重影响甜瓜产业发展。中国南瓜曲叶病毒（squash leaf curl China virus）和甜瓜坏死斑点病毒（melon necrotic spot virus）是中国新近报道为害甜瓜的种。为阐明两种病毒的致病机理,构建了SLCCNV和MNSV两种甜瓜病毒的侵染性克隆,分析了病毒编码的病毒致病因子,以期为防控该病毒病奠定基础。目前取得以下结果:1、鉴定了甜瓜是SLCCNV的新寄主,构建了SLCCNV侵染性克隆并进行了烟粉虱传染试验。测定了SLCCNV-HN全基因组序列并进行了系统进化分析,结果表明SLCCNV-HN甜瓜分离物与SLCCNV-Hn南瓜分离物、SLCCNV-Hn61和SLCCNV-SY西葫芦分离物聚为一类。构建了SLCCNV-HN侵染性克隆载体,接种甜瓜后植株矮化、叶片皱缩。进行了烟粉虱传染试验,发现烟粉虱接种的植株表现出与接种野生型一致的症状。2、明确了AC5基因是SLCCNV的致病因子,证实了AC5是SLCCNV编码的沉默抑制子,其沉默抑制活性与核定位信号相关。将表达AC5基因的PVX异源载体接种本氏烟后叶片表现枯斑、皱缩,表明AC5是致病因子并激发了植物的过敏性坏死反应,DAB染色说明过敏性坏死反应与H2O2的积累相关。不仅如此,利用SLCCNV侵染性克隆定点突变AC5基因,进一步证实了AC5基因是该病毒的致病因子。利用p35S-AC5与p35S-GFP共浸润接种16c本氏烟,接种5 d后接种部位出现明显的绿色荧光信号,表明了AC5基因可抑制局部沉默。利用p35S-GFP、p35S-dsGFP和p35S-AC5共浸润野生本氏烟,接种5 d后在接种部位未发现绿色荧光信号,表明AC5不抑制双链GFP（IR-PTGS）诱导的沉默。在AC5基因ORF之前引入终止密码子,明确了AC5是在蛋白水平发挥作用。利用AC5核定位信号缺失突变体与p35S-GFP共浸润16c本氏烟,发现该突变体失去了沉默抑制作用,表明AC5蛋白的核定位信号与沉默抑制活性相关。3、证实了p42是MNSV的致病因子,与寄主因子3-羟基异丁酸脱氢酶（3-Hydroxyisobutyrate dehydrogenase-like 1,3HID1）互作。将表达p42基因的PVX异源载体接种本氏烟后植株新叶枯死,证实p42是MNSV的致病因子。构建了MNSV侵染性克隆,在此基础上构建了携带GFP的MNSV侵染性克隆载体。在MNSV侵染性克隆的基础上进行了p42基因突变,发现p42的R-domain和S-domain是致病功能域。此外,构建了受MNSV侵染的甜瓜cDNA文库,筛选到与p42互作的6个寄主因子,经酵母双杂交、BIFC及共定位一对一验证,表明3HID1与p42互作,本研究为揭示p42与寄主互作的机制奠定了基础。
梁乐乐[9]（2019）在《小麦黄花叶病毒CP与寄主FtsH2互作研究》文中指出小麦黄花叶病毒（Wheat yellow mosiaic virus,WYMV）是马铃薯 Y 病毒科（Potyviridae）大麦黄花叶病毒属（Bymovirus）成员。关于小麦黄花叶病症状形成机制研究比较少,本课题组前期通过酵母双杂交筛选小麦cDNA文库,发现TaFtsH2蛋白部分片段与WYMV CP互作。外壳蛋白（coat protein,CP）是病毒唯一的结构蛋白,参与病毒粒子的包装、移动和症状表现等过程。FtsH2蛋白是AAA蛋白酶家族成员,参与植物叶绿体光损伤修复和类囊体发育进程。为进一步研究TaFtsH2与WYMV CP互作关系,探究WYMV CP与TaFtsH2蛋白互作在病毒侵染与症状表现中发挥的功能,进行了以下研究工作:1.TaFtsH2生物信息学分析克隆了小麦TaFtsH2基因CDS序列并利用生物信息学软件分析了TaFtsH2基因的相似性及结构域。结果显示TaFtsH2蛋白具有N端的跨膜结构域、中间的AAA结构域和C端的PeptidaseM41结构域。TaFtsH2氨基酸序列与山羊草的序列相似度最高,达到100%;其次为二穗短柄草,序列相似度为95.25%;与玉米、水稻和高粱的氨基酸序列相似性也大于90%,分别为 91%、92.02%、91%。2.WYMV CP与TaFtsH2蛋白互作验证重组质粒pGADT7-TaFtsH2与pGBKT7-CPWYMV共转酵母感受态细胞,结果表明WYMV CP与TaFtsH2蛋白互作。将含有TaFtsH2-YFPn和CPWYMV-YFPc重组质粒的农杆菌共浸润烟草,激光共聚焦显微镜下观察到绿色荧光,证明WYMVCP与TaFtsH2蛋白互作。3.WYMV CP与TaFtsH2蛋白的共定位分析将WYMV CP与TaFtsH2序列克隆到荧光表达载体上,浸润烟草48 h后观察发现CP-GFP单独表达时主要定位在细胞质中,TaFtsH2-GFP蛋白单独表达时主要定位在细胞质和细胞核中,少量定位在叶绿体中。当CP-RFP与TaFtsH2-GFP蛋白同时表达时两者亚细胞定位没有发生明显改变,且主要共定位于细胞质中。4.WYMV侵染小麦后对TaFtsH2表达量的影响通过实时荧光定量PCR检测TaFtsH2 mRNA相对含量,结果显示TaFtsH2 mRNA相对量随病叶严重度增加出现先升高后下降的趋势;1级和2级病叶与健康叶片相比TaFtsH2表达量显着上调,分别上调1.72倍和2.81倍,3级和4级病叶TaFtsH2表达量又恢复到健康叶片水平。5.NbFtsH2对病毒侵染的影响克隆了烟草NbFtsH2全长,其氨基酸序列与TaFtsH2整体相似度达到82.88%,酵母双杂交证明其与TuMV CP互作。利用VIGS技术沉默NbFtsH2,本氏烟的叶片出现退绿黄化的现象。注射接种TuMV-GFP侵染性克隆,与对照相比TuMV在NbFtsH2基因沉默的本氏烟中表达量明显减少,说明FtsH2基因与症状表现有关,沉默NbFtsH2基因不利于TuMV的侵染。本研究对了解WYMV的症状形成机制具有一定意义。
张鹏远[10]（2016）在《薯蓣褪绿坏死花叶病毒的普通生物学及分子生物学研究》文中指出薯蓣褪绿坏死花叶病毒（Yam chlorotic necrotic mosaic virus,YCNMV）是马铃薯Y病毒科（family Potyviridae）柘橙病毒属(genus 的一个暂定成员。该病毒是本课题组2009年在云南省永胜县的野生小花盾叶薯蓣上发现并命名的。由于该病毒当时只测定了 4个分离物的3’端序列（包括部分nib基因序列、完整cp基因和3’-UTR序列）,尚有诸多关键信息未被明确,其分类地位也还需大量的实验证据支持。为了进一步明确该病毒的分类地位,增加对YCNMV的认识,本研究开展了 YCNMV的全基因组序列测定、普通生物学特性和cp基因的分子遗传多样性研究,并建立了 YCNMV血清学和RT-PCR（Reverse transcription PCR）检测体系。同时,还构建了 T7启动子下的YCNMV的侵染性克隆,并初步完成了对部分YCNMV疑似运动蛋白的亚细胞定位。具体研究工作如下:（1）对YCNMV的普通生物学及基因组结构进行了初步研究YCNMV粒子呈曲线状,大小为600-700X 13 nm,具有典型Potyviridae科病毒风轮状内含体。利用RACE方法获得了 YCNMV的全基因组序列。基因组结构分析表明,YCNMV具有Potyviridae科成员中最小的基因组结构,其基因组序列全长8 208 nt（不含Poly A尾）;基因组包含一个大的ORF（由7 866 nt组成,编码2 621 aa）,编码9个功能基因,在p3基因内同样存在一个PIPO移动阅读框,但与Potyviridae科其它病毒相比缺乏p1基因结构域。在YCNMV基因组中未发现与蚜传相关的PTK、KITC和DAG保守基序。YCNMV与Macluravirus病毒属另外两个病毒:中国薯蓣坏死花叶病毒（Chinese yam necrotic mosaic virus,CYNMV）和菊芋潜隐病毒（Artichoke laten virus,ArLV）的全基因组核苷酸序列同源性为55.22-72.91%,ORF核苷酸序列同源性为56.08-73.09%,ORF氨基酸序列同源性为49.40-80.66%,cp基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为51.40-70.57%和40.72-70.24%。根据ICTV Potyviridae科cp基因或全基因组序列核苷酸低于76%,CP氨基酸序列同源性低于80%的分类标准,YCNMV应是Potyviridae科Macluravirus属的一个新成员。YCNMV与Potyviridae科其它属ORF核苷酸和氨基序列构建的系统进化树分析也表明,YCNMV明显的被归在Macluravirus属内,与CYNMV在同一簇内,但存在明显的进化分支。以磨擦、浸润接种等方法在多种常见宿主植物上开展的接种实验表明,所接种植物未能检测到YCNMV病毒。利用蚜虫接种后,在接种薯蓣和本生烟植株上也没有检测到YCNMV病毒。这些结果表明,YCNMV或具有相对狭窄的寄主范围,或以其他方式进行传播。以ID-ELISA法检测YCNMV与部分Potyviridae科病毒成员的血清学关系,结果表明YCNMV与所检测病毒不具有或仅有极弱的血清学反应,上述结果表明YCNMV与所检测的Potyviridae科其他病毒成员血清学关系较远。（2）建立了 YCNMV血清学检测体系和分子生物学检测体系成功构建了 YCNMV cp基因原核表达载体,将纯化后的CP重组蛋白免疫新西兰大白兔制备获得高效价的抗血清。利用该抗血清建立了 ID-ELISA、Dot-ELISA、Western blot等YCNMV特异性血清学检测体系。通过设计简并引物、特异检测引物及特异qPCR检测引物,建立了针对YCNMV的RT-PCR、qRT-PCR分子生物学检测体系。采用本研究建立的检测体系检测了从云南省境内多地采集的疑似感病薯蓣样品共计171株,并从中检出20株YCNMV分离物,获得了其3’端序列（包括部分nib基因、完整cp基因和3’-UTR序列）。上述结果表明,所构建的检测体系稳定且特异性好,可用于后续YCNMV检测。（3）开展了 YCNMV cp基因分子遗传多样性研究结合从NCBI上获得的部分Potyviridae科其他成员序列信息,以及测序获得的20株YCNMV分离物序列信息,对YCNMV进行了分子遗传多样性研究。cp基因、CP氨基酸和3’-UTR序列生物信息学分析表明,YCNMV具有丰富的遗传多样性,且多样性程度明显高于CYNMV。重组分析显示,YCNMV基因重组不明显,但YCNMV同时具有很高的核苷酸位点多态性（Pi）（0.16114±0.01333）及单倍型多态性（0.996±0.013）（Hd）,表明YCNMV分子遗传多样性程度相对较高。选择压力分析表明YCNMV总体处于强烈的净化选择压力（Purifiying selection）下（dN/dS=0.1257）,基因进化较保守,但依然从YCNMV不同分离物cp基因中检出4个疑似零散多向型选择位点,其中Codon273位点具有显着差异（p≤0.05）。（4）利用Infusion技术构建了 T7启动子下的YCNMV侵染性克隆构建了 YCNMV的全长侵染性克隆载体（pSKycnmv）,测序结果表明,该侵染性克隆序列正确,没有发生碱基的插入、缺失及重组等突变。但体外转录物磨擦接种本生烟、心叶烟7天及22天后RT-PCR暂未检测到YCNMV,其侵染性有待进一步确认。（5）检测了 4个YCNMV可能运动蛋白的亚细胞定位将YCNMV的4个疑似运动蛋白分别与GFP在本氏烟中融合表达后,利用共聚焦显微镜观察浸润叶片下表皮细胞。结果表明,HC-Pro,VPg及CP主要定位于细胞核及细胞质中,无明显趋向性分布。CI主要定位于细胞核及细胞壁/质膜上,并在细胞壁/质膜上呈现点刻状分布。据此推测,CI可能是YCNMV定位于胞间连丝上的主要运动蛋白之一。综上所述,以上工作为YCNMV分类地位的确定,深入理解YCNMV的种群遗传结构及YCNMV的侵染机制奠定了基础。
二、大麦黄花叶病毒属成员UTR系统进化树分析及编码蛋白跨膜结构推测（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、大麦黄花叶病毒属成员UTR系统进化树分析及编码蛋白跨膜结构推测（论文提纲范文）
（1）侵染猕猴桃的负义RNA病毒的鉴定及编码蛋白的互作研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 正番茄斑萎病毒属病毒的危害及分子特性 |
| 1.1.1 正番茄斑萎病毒属病毒的危害特点及传播 |
| 1.1.2 正番茄斑萎病毒属病毒的分类依据及主要病毒种类 |
| 1.1.3 正番茄斑萎病毒属病毒基因组表达策略及编码蛋白的功能 |
| 1.2 欧洲花楸环斑病毒属病毒的生物学和分子特性 |
| 1.2.1 欧洲花楸环斑病属的建立和主要病毒的种类 |
| 1.2.2 欧洲花楸环斑病毒属病毒的基因组结构及病毒粒子特征 |
| 1.2.3 欧洲花楸环斑病毒属病毒编码蛋白功能研究进展 |
| 1.2.4 欧洲花楸环斑病毒属病毒的分子变异及群体结构 |
| 1.3 植物弹状病毒的种类和分子特性 |
| 1.3.1 植物弹状病毒属的划分 |
| 1.3.2 植物弹状病毒的生物学特性 |
| 1.3.3 植物弹状病毒的基因组结构和病毒粒子特征 |
| 1.3.4 植物弹状病毒的复制及组装 |
| 1.3.5 植物弹状病毒编码蛋白的功能研究 |
| 1.4 高通量测序技术鉴定的果树负义RNA病毒 |
| 1.5 侵染猕猴桃的病毒种类 |
| 1.6 研究目的和意义 |
| 第二章 侵染猕猴桃的番茄坏死斑伴随病毒和凤仙花坏死斑病毒的鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 研究方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 猕猴桃样品Z1的sRNA测序数据分析 |
| 2.2.2 TNSaV-Ac基因组序列分析 |
| 2.2.3 来源于TNSaV-Ac的sRNA分析 |
| 2.2.4 INSV-Ac基因组序列测定及分析 |
| 2.2.5 系统进化分析 |
| 2.2.6 正番茄斑萎病毒属病毒的RT-PCR检测 |
| 2.3 小结与讨论 |
| 第三章 猕猴桃欧洲花楸环斑病毒2 分子特性 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 用于AcEV-2的基因组扩增和检测的引物 |
| 3.1.3 总RNA的提取和RT-PCR扩增 |
| 3.1.4 AcEV-2的RNA1链的5'和3'末端序列的获得 |
| 3.1.5 PCR产物的回收、连接、转化及测序 |
| 3.1.6 序列分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 AcEV-2的发现和基因组序列扩增 |
| 3.2.2 AcEV-2基因组序列分析 |
| 3.2.3 AcEV-2的系统进化关系 |
| 3.2.4 AcEV-2的RT-PCR检测 |
| 3.2.5 RT-PCR检测AcEV-2的6条RNA链 |
| 3.3 小结与讨论 |
| 第四章 AcCRaV和AcEV-2编码的非保守与保守蛋白之间的互作 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 目的基因来源 |
| 4.1.2 植物材料 |
| 4.1.3 载体及菌株 |
| 4.1.4 亚细胞定位和BiFC试验载体的构建 |
| 4.1.5 质粒的提取 |
| 4.1.6 农杆菌介导的本氏烟叶片瞬时表达系统 |
| 4.1.7 荧光信号观察 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 AcCRaV的P5可与该病毒4个保守蛋白之间的互作 |
| 4.2.2 AcEV-2的P5和P6与4个保守蛋白之间的互作 |
| 4.2.3 AcCRaV和AcEV-2编码蛋白的亚细胞定位分析 |
| 4.2.4 AcCRaV和AcEV-2编码蛋白的亚细胞定位特点比较 |
| 4.3 小结与讨论 |
| 第五章 猕猴桃病毒D分子特性及其编码蛋白的互作 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 植物材料 |
| 5.1.2 载体及菌株 |
| 5.1.3 HTS数据分析 |
| 5.1.4 用于AcVD基因组扩增和检测的引物 |
| 5.1.5 亚细胞定位和BiFC试验载体的构建 |
| 5.1.6 DUALmembrane系统酵母双杂交 |
| 5.1.7 总RNA的提取、RT-PCR和5'和3'RACE |
| 5.1.8 克隆、测序和序列分析 |
| 5.1.9 瞬时表达和荧光信号的观察 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 AcVD的发现及序列分析 |
| 5.2.2 系统进化分析 |
| 5.2.3 AcVD编码蛋白的亚细胞定位研究 |
| 5.2.4 AcVD编码的M蛋白与微管相关 |
| 5.2.5 AcVD编码的蛋白相互作用研究 |
| 5.2.6 AcVD的RT-PCR检测 |
| 5.3 小结与讨论 |
| 第六章 全文总结与展望 |
| 6.1 全文总结 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录1:系统进化树(图5.5)所用病毒蛋白的登录号 |
| 附录2:猕猴桃样品中6 种病毒的RT-PCR检测结果 |
| 附录3:常用试剂和培养基的配方 |
| 附录4:pMD18-T克隆载体图谱 |
| 附录5:pCNF3和eYFP载体图谱 |
| 附录6:研究生期间发表的研究论文和会议摘要 |
| 致谢 |
（2）黑尾叶蝉感染水稻矮缩病毒后唾液腺转录组变化分析及其两种RNA病毒基因组结构分析（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 病毒组研究现状 |
| 1.1 病毒组发展简介 |
| 1.2 病毒组研究内容简介 |
| 1.3 病毒基础分类 |
| 2 Iflaviridae病毒科研究现状 |
| 2.1 Iflaviridae病毒科简介与分类 |
| 2.2 Iflaviridae病毒科病毒基因组结构 |
| 2.3 Iflaviridae病毒科病毒粒子结构 |
| 2.4 Iflaviridae病毒科病毒感染症状 |
| 2.5 Iflaviridae病毒科病毒传播途径 |
| 2.6 Iflaviridae病毒科病毒宿主范围 |
| 2.7 Iflaviridae病毒科病毒与其他微生物的共感染与互作 |
| 2.8 Iflaviridae病毒科病毒与寄生节肢动物 |
| 3 Rhabdoviridae病毒科研究现状 |
| 3.1 Rhabdoviridae病毒科病毒简介与分类 |
| 3.2 Rhabdoviridae病毒科病毒基因组结构 |
| 3.3 Rhabdoviridae病毒科病毒的转录与表达 |
| 3.4 Rhabdoviridae病毒科病毒基因组的扩张与收缩 |
| 4 水稻矮缩病毒研究概述 |
| 4.1 水稻矮缩病毒简介 |
| 4.2 水稻矮缩病毒的传播 |
| 5 本论文研究目的与路线 |
| 第二章 黑尾叶蝉RDV感染与未感染唾液腺转录组比较分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试昆虫 |
| 1.2 黑尾叶蝉唾液腺解剖 |
| 1.3 黑尾叶蝉唾液腺总RNA提取 |
| 1.4 黑尾叶蝉唾液腺c DNA合成 |
| 1.5 荧光定量PCR检测 |
| 1.6 黑尾叶蝉唾液腺中RDV病毒增殖情况检测 |
| 1.7 黑尾叶蝉唾液腺中RDV病毒透射电镜观察 |
| 1.8 黑尾叶蝉唾液腺转录组样品制备 |
| 1.9 黑尾叶蝉唾液腺cDNA文库制备与库检 |
| 1.10 文库测序、拼接注释与CDS预测 |
| 1.11 黑尾叶蝉唾液腺转录组差异表达基因分析与筛选 |
| 1.12 差异基因富集分析 |
| 1.13 差异基因验证 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 黑尾叶蝉唾液腺RDV病毒检测 |
| 2.2 黑尾叶蝉唾液腺转录组数据概况 |
| 2.3 基因GO、KOG和 KEGG功能分析 |
| 2.4 差异基因的筛选与统计 |
| 2.5 差异基因的GO富集分析 |
| 2.6 差异基因的KEGG富集分析 |
| 2.7 昆虫相关差异基因验证 |
| 2.8 病毒相关差异基因及验证 |
| 3 讨论 |
| 第三章 黑尾叶蝉ML基因鉴定及ML蛋白与RDV互作研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试昆虫 |
| 1.2 黑尾叶蝉总RNA提取与c DNA合成 |
| 1.3 黑尾叶蝉NcML基因鉴定与生物学分析 |
| 1.4 黑尾叶蝉NcML基因序列扩增 |
| 1.5 黑尾叶蝉NcML基因表达分布检测 |
| 1.6 黑尾叶蝉NcML蛋白与RDV病毒蛋白酵母双杂交互作验证 |
| 1.7 蛋白SDS-PAGE和 Western blot检测 |
| 1.8 蛋白表达纯化与Pull-Down互作验证 |
| 1.9 黑尾叶蝉NcML基因ds RNA合成与RNA干扰 |
| 1.10 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 黑尾叶蝉NcML基因鉴定与生物学分析 |
| 2.2 黑尾叶蝉NcML蛋白结构预测 |
| 2.3 黑尾叶蝉NcML基因组织和发育动态分布 |
| 2.4 黑尾叶蝉NcML与 RDV病毒蛋白互作 |
| 2.5 黑尾叶蝉NcML蛋白与Lipid A分子对接预测 |
| 2.6 黑尾叶蝉NcML基因RNAi |
| 3 讨论 |
| 第四章 黑尾叶蝉(+)ssRNA病毒NcPSRV-1基因组结构与传播模式研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试昆虫 |
| 1.2 黑尾叶蝉总RNA提取与c DNA合成 |
| 1.3 黑尾叶蝉(+)ssRNA病毒NcPSRV-1基因组序列克隆与测序 |
| 1.4 黑尾叶蝉(+)ssRNA病毒NcPSRV-1生物信息学与系统进化分析 |
| 1.5 黑尾叶蝉(+)ssRNA病毒NcPSRV-1检测与定量分析 |
| 1.6 黑尾叶蝉(+)ssRNA病毒NcPSRV-1与RDV田间共感染调查 |
| 1.7 黑尾叶蝉(+)ssRNA病毒NcPSRV-1实验室种群带毒率检测 |
| 1.8 黑尾叶蝉(+)ssRNA病毒NcPSRV-1水平传播检测 |
| 1.9 黑尾叶蝉(+)ssRNA病毒NcPSRV-1垂直传播检测 |
| 1.10 黑尾叶蝉(+)ssRNA病毒NcPSRV-1宿主范围检测 |
| 1.11 黑尾叶蝉(+)ssRNA病毒NcPSRV-1与RDV实验室种群共感染检测 |
| 1.12 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 黑尾叶蝉(+)ssRNA病毒NcPSRV-1基因组序列分析 |
| 2.2 黑尾叶蝉(+)ssRNA病毒NcPSRV-1基因组结构分析 |
| 2.3 黑尾叶蝉(+)ssRNA病毒NcPSRV-1系统进化分析 |
| 2.4 黑尾叶蝉(+)ssRNA病毒NcPSRV-1成虫带毒检测 |
| 2.5 黑尾叶蝉(+)ssRNA病毒NcPSRV-1与RDV田间共感染调查 |
| 2.6 黑尾叶蝉(+)ssRNA病毒NcPSRV-1实验室种群丰度变化 |
| 2.7 黑尾叶蝉(+)ssRNA病毒NcPSRV-1水平传播检测 |
| 2.8 黑尾叶蝉(+)ssRNA病毒NcPSRV-1垂直传播检测 |
| 2.9 黑尾叶蝉(+)ssRNA病毒NcPSRV-1宿主检测 |
| 2.10 黑尾叶蝉(+)ssRNA病毒NcPSRV-1与RDV的共感染 |
| 3 讨论 |
| 第五章 黑尾叶蝉(-)ssRNA病毒NcNSRV-1基因组结构与进化分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试昆虫 |
| 1.2 黑尾叶蝉总RNA提取与cDNA合成 |
| 1.3 黑尾叶蝉(-)ssRNA病毒NcNSRV-1基因组序列克隆与测序 |
| 1.4 黑尾叶蝉(-)ssRNA病毒NcNSRV-1生物信息学与系统进化分析 |
| 1.5 黑尾叶蝉(-)ssRNA病毒NcNSRV-1检测 |
| 1.6 黑尾叶蝉(-)ssRNA病毒NcNSRV-1与RDV田间共感染调查 |
| 1.7 黑尾叶蝉(-)ssRNA病毒NcNSRV-1实验室种群带毒率检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 黑尾叶蝉(-)ssRNA病毒NcNSRV-1基因组序列分析 |
| 2.2 黑尾叶蝉(-)ssRNA病毒NcNSRV-1系统进化分析 |
| 2.3 黑尾叶蝉(-)ssRNA病毒NcNSRV-1基因组结构横向比较分析 |
| 2.4 黑尾叶蝉(-)ssRNA病毒NcNSRV-1基因连接区序列分析 |
| 2.5 黑尾叶蝉(-)ssRNA病毒NcNSRV-1与RDV田间共感染调查 |
| 2.6 黑尾叶蝉(-)ssRNA病毒NcNSRV-1实验室种群带毒率检测 |
| 3 讨论 |
| 总结 |
| 1 本论文的特色与创新点 |
| 2 本论文的不足之处 |
| 3 未来的研究方向 |
| 附录Ⅰ 黑尾叶蝉水状唾液蛋白质组分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试昆虫 |
| 1.2 黑尾叶蝉唾液收集 |
| 1.3 黑尾叶蝉唾液蛋白样品处理及SDS-PAGE电泳 |
| 1.4 黑尾叶蝉唾液蛋白FASP酶解、ESI质谱鉴定与数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 黑尾叶蝉唾液蛋白SDS-PAGE电泳与质谱鉴定 |
| 2.2 黑尾叶蝉水状唾液蛋白质组数据统计 |
| 2.3 黑尾叶蝉水状唾液蛋白质组成分析 |
| 2.4 黑尾叶蝉水状唾液蛋白差异表达基因 |
| 2.5 黑尾叶蝉水状唾液蛋白质组病毒相关序列 |
| 3 讨论 |
| 附录Ⅱ |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
（3）基于RNA-seq的水稻新病毒RCDaV的鉴定及水稻响应RBSDV侵染的lncRNA-mRNA调控网络研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 高通量测序在植物病毒研究中的应用 |
| 1.1.1 高通量测序简述 |
| 1.1.2 利用NGS技术发现新病毒 |
| 1.1.3 利用基于NGS的转录组测序研究寄主响应病毒侵染 |
| 1.1.4 长非编码RNA在植物中功能简述 |
| 1.2 小RNA病毒目简介 |
| 1.2.1 小RNA病毒目病毒的分类及其基因组特征 |
| 1.2.2 正链RNA病毒编码的蛋白酶 |
| 1.2.3 小RNA病毒目病毒编码的蛋白酶 |
| 1.3 水稻黑条矮缩病毒研究进展 |
| 1.3.1 水稻黑条矮缩病的危害与症状 |
| 1.3.2 水稻黑条矮缩病毒粒子形态 |
| 1.3.3 水稻黑条矮缩病毒基因组结构及其编码蛋白 |
| 1.4 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 植物总RNA提取 |
| 2.2.2RNA反转录 |
| 2.2.3 高保真PCR |
| 2.2.4 PCR产物的纯化回收 |
| 2.2.5 限制性内切酶消化 |
| 2.2.6 同源重组载体构建 |
| 2.2.7 3’和5’RACE |
| 2.2.8 RT-qPCR |
| 2.2.9 聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳 |
| 2.2.10 Western blot |
| 3 水稻卷曲矮缩相关病毒的鉴定及其编码蛋白酶的功能研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.1.2.1 高通量测序及序列拼接 |
| 3.1.2.2 位点定向突变 |
| 3.1.2.3 体外蛋白酶切割实验 |
| 3.1.2.4 蛋白原核表达纯化与蛋白N端测序 |
| 3.1.2.5 生物信息学分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 一种新的水稻小RNA病毒的鉴定 |
| 3.2.2 新病毒的基因组特征 |
| 3.2.3 RCDaV 3Cpro的顺式切割活性 |
| 3.2.3.1 RCDaV 3Cpro具有体外顺式切割活性 |
| 3.2.3.2 RCDaV 3Cpro催化三联体的鉴定 |
| 3.2.3.3 N端测序确定RCDaV 3Cpro顺式切割位点 |
| 3.2.3.4 无细胞蛋白表达系统验证RCDaV 3Cpro顺式切割位点 |
| 3.2.4 RCDaV3Cpro的反式切割活性 |
| 3.2.5 RCDaV编码的多聚蛋白上各蛋白切割位点的鉴定 |
| 3.2.5.1 P1区域的各蛋白切割位点鉴定 |
| 3.2.5.2 P2区域的各蛋白切割位点鉴定 |
| 3.2.5.3 P3区域的各蛋白切割位点鉴定 |
| 3.2.6 RCDaV 3Cpro切割位点保守性分析 |
| 3.2.7 RCDaV与小RNA病毒目下其他病毒的系统发育关系 |
| 3.2.8 新建立的科中有相同的蛋白酶切割模式 |
| 3.2.9 MaPV和 ApGIV1切割位点验证 |
| 3.3 讨论 |
| 4 水稻响应RBSDV侵染的lncRNA-mRNA调控网络研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.1.2.1 水稻培养及RBSDV病毒接种 |
| 4.1.2.2 转录组测序及组装 |
| 4.1.2.3 lncRNA的鉴定 |
| 4.1.2.4 mRNA与lncRNA差异表达分析 |
| 4.1.2.5 GO注释与KEGG富集 |
| 4.1.2.6 DElncRNA靶向mRNA的预测 |
| 4.1.2.7 lncRNA-mRNA调控网络的构建 |
| 4.1.2.8 水稻愈伤组织的诱导及农杆菌侵染 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 转录组测序结果 |
| 4.2.2 RBSDV侵染后水稻差异表达的mRNA和lncRNA |
| 4.2.3 DEmRNA的功能特征 |
| 4.2.4 DElncRNA调控基因的功能分析 |
| 4.2.5 DElncRNA-DEmRNA的共表达网络 |
| 4.2.6 DEmRNA和DElncRNA转录组表达模式的RT-qPCR验证 |
| 4.2.7 lncRNA对mRNA反式调控关系验证 |
| 4.3 讨论 |
| 5 全文总结、创新点与展望 |
| 附文Ⅰ RBSDV外壳蛋白与灰飞虱卵黄原蛋白及受体的分子互作 |
| 1.1 文献综述 |
| 1.1.1 卵黄原蛋白及受体 |
| 1.1.2 病毒利用Vg或者Vg R突破卵巢屏障 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.2.1 材料 |
| 1.2.1.1 植物材料、飞虱 |
| 1.2.1.2 质粒、菌株、试剂及抗体 |
| 1.2.2 激光共聚焦显微镜观察昆虫卵巢组织 |
| 1.3 结果与分析 |
| 1.3.1 Ls Vg、Ls Vg R序列特征 |
| 1.3.2 RBSDV CP与 LsVg、LsVgR间的互作 |
| 1.3.3 RBSDV CP与 LsVg、LsVgR在灰飞虱卵巢组织共定位 |
| 1.3.4 RBSDV CP与 RSV CP在灰飞虱未孵育虫卵中的定位 |
| 1.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ 本文所用引物列表 |
| 附录Ⅱ RCDaV基因组全序列 |
| 附录Ⅲ 进化树中所用到的病毒 |
| 附录Ⅳ 常见专业名词中英文对照及缩写 |
| 附录Ⅴ 常用缓冲液和培养基配方 |
（4）酵母双杂交筛选与小麦黄花叶病毒P2互作的寄主因子及其功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 小麦黄花叶病毒(WYMV)研究进展 |
| 1.1.1 小麦黄花叶病的发生与分布 |
| 1.1.2 小麦黄花叶病的症状 |
| 1.1.3 小麦黄花叶病的病原和传播媒介 |
| 1.2 小麦黄花叶病毒(WYMV)分子生物学特点 |
| 1.2.1 小麦黄花叶病毒的基因组结构及其功能 |
| 1.3 TIFY家族研究现状 |
| 1.3.1 TIFY蛋白的结构特征 |
| 1.3.2 TIFY蛋白的生物学功能 |
| 1.4 酵母双杂交系统在植物病毒学领域的运用 |
| 1.4.1 酵母双杂交的原理 |
| 1.4.2 酵母双杂交蛋白质互作中的广泛应用 |
| 1.4.3 蛋白互作方法简述 |
| 1.5 研究的目的意义 |
| 第二章 酵母双杂交筛选寄主候选因子 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 植物材料 |
| 2.2.2 cDNA文库、质粒和菌株 |
| 2.2.3 主要试验试剂 |
| 2.2.4 主要仪器 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 小麦cDNA文库构建 |
| 2.3.2 文库质量的测定 |
| 2.3.3 Y2HGold酵母感受态细胞的制备 |
| 2.3.4 设计PCR引物 |
| 2.3.5 目的基因扩增 |
| 2.3.6 片段纯化 |
| 2.3.7 双酶切 |
| 2.3.8 连接 |
| 2.3.9 大肠感受态DH5α转化 |
| 2.3.10 菌落检测及提取质粒 |
| 2.3.11 提取质粒 |
| 2.3.12 酵母重组质粒自激活检测 |
| 2.3.13 小麦cDNA文库筛选 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 小麦cDNA文库的构建及检测 |
| 2.4.2 诱饵载体的构建 |
| 2.4.3 筛选与WYMV-P2 互作寄主因子 |
| 2.5 小结与讨论 |
| 第三章 候选因子NbTIFY10A/TaTIFY10b的功能研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 小结与分析 |
| 3.3.1 TaTIFY10b与NbTIFY10A的克隆与序列分析 |
| 3.3.3 P2 蛋白与NbTIFY10A/TaTIFY10b在酵母中的互作 |
| 3.3.4 P2与NbTIFY10A/TaTIFY10b亚细胞定位 |
| 3.3.5 利用BiFC验证P2与NbTIFY10A互作 |
| 3.3.6 P2与NbTIFY10A植物体外互作验证 |
| 3.3.7 利用活体生物体内光学成像系统P2与NbTIFY10A互作 |
| 3.3.8 VIGS介导基因沉默 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 第四章 总结与展望 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录一 攻读硕士学位期间发表的学术论文目录 |
（5）酵母双杂交筛选与小麦黄花叶病毒P2互作的寄主因子（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 小麦cDNA构建 |
| 1.2.2 文库质量的测定 |
| 1.2.3 Y2HGold酵母感受态细胞的制备 |
| 1.2.4 重组诱饵载体pGBKT7-P2的构建 |
| 1.2.5 小麦cDNA文库筛选 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 小麦cDNA文库的构建及检测 |
| 2.2 诱饵载体的构建 |
| 2.3 筛选与WYMV-P2互作寄主因子 |
| 3 讨论 |
（6）SsNSRV-1基因功能及其与核盘菌互作机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 前言 |
| 1.核盘菌及油菜菌核病 |
| 1.1 核盘菌及其分类地位 |
| 1.2 油菜菌核病及其病害循环 |
| 1.3 核盘菌的致病机理 |
| 1.4 菌核病的防治 |
| 2.真菌病毒及其多样性 |
| 2.1 病毒与真菌病毒的发现 |
| 2.2 真菌病毒的分类 |
| 2.3 真菌病毒的广泛分布 |
| 2.4 真菌病毒的传播方式 |
| 2.5 真菌病毒的应用 |
| 3.真菌病毒与寄主互作研究 |
| 3.1 真菌病毒对寄主的影响 |
| 3.2 真菌对真菌病毒的影响 |
| 3.3 真菌病毒-寄主互作研究 |
| 4.转录组学与真菌病毒研究 |
| 4.1 转录组学及转录组测序(RNA-Seq)简介 |
| 4.2 转录组数据的分析流程 |
| 4.3 转录组学在真菌病毒研究中的应用 |
| 5.代谢组学及其应用 |
| 5.1 代谢组学的基本概念 |
| 5.2 代谢组的研究方法 |
| 5.3 代谢组数据分析 |
| 5.4 代谢组学在微生物研究中的应用 |
| 6.单股负义链RNA病毒与SsNSRV-1 |
| 6.1 单股负义链RNA病毒 |
| 6.2 Mymonaviridae的建立 |
| 6.3 核盘菌负链病毒SsNSRV-1 |
| 7.本研究的目的意义 |
| 第二章 利用高通量测序分析菌株AH98中的病毒 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 研究材料 |
| 1.2 主要试剂及仪器 |
| 1.3 研究方法 |
| 1.3.1 菌株的培养 |
| 1.3.2 RNA提取及cDNA合成 |
| 1.3.3 测序方案 |
| 1.3.4 数据分析流程 |
| 1.3.5 病毒序列的验证和分析 |
| 2.结果分析 |
| 2.1 测序数据QC质量分析 |
| 2.2 测序获得的病毒验证 |
| 2.3 病毒SsNSRV-5X |
| 2.3.1 SsNSRV-5X的基因组结构 |
| 2.3.2 SsNSRV-5X基因功能预测 |
| 2.3.3 SsNSRV-5X的系统发育分析 |
| 2.4 BcHV1/AH98 的基因组结构和进化树分析 |
| 3.小结与讨论 |
| 3.1 小结 |
| 3.2 讨论 |
| 3.2.1 AH98被6种病毒复合侵染 |
| 3.2.2 AH98的弱毒特性由多种病毒共同导致 |
| 3.2.3 病毒BcHV1存在跨属传播的现象 |
| 3.2.4 SsNSRV-5X可能代表Mymonaviridae科病毒一个新的属 |
| 第三章 SsNSRV-1 基因超表达转化子的表达特性 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 研究材料 |
| 1.2 主要试剂及仪器 |
| 1.3 培养基 |
| 1.4 研究方法 |
| 1.4.1 菌株的培养和保存 |
| 1.4.2 真菌DNA提取 |
| 1.4.4 RNA提取及cDNA合成 |
| 1.4.5 农杆菌介导真菌的遗传转化 |
| 1.4.6 ORF超表达转化子PCR验证 |
| 2.结果分析 |
| 2.1 核盘菌超表达转化子中病毒基因的表达特性 |
| 2.2 病毒基因剪切位点的序列特征 |
| 2.3 病毒ORF Ⅲ的剪切现象在禾谷镰孢菌和稻瘟菌中存在 |
| 3.小结与讨论 |
| 3.1 小结 |
| 3.2 讨论 |
| 3.2.1 病毒SsNSRV-1 基因被真菌内含子剪接系统编辑 |
| 3.2.2 病毒SsNSRV-1 可能存在防止内含子剪接的机制 |
| 3.2.3 病毒SsNSRV-1 N基因具有两个转录峰 |
| 第四章 结合转录组技术揭示SsNSRV-1 的基因功能及其与核盘菌互作机理 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 研究材料 |
| 1.2 主要试剂及仪器 |
| 1.3 研究方法 |
| 1.3.1 转录组测序样品制备 |
| 1.3.2 转录组数据分析方法 |
| 1.3.3 病毒SsNSRV-1 蛋白的定位、结构和功能预测 |
| 2.结果与分析 |
| 2.1 转录组测序样品质量检测 |
| 2.2 测序数据质量评估 |
| 2.3 测序数据比对基因组 |
| 2.4 基因ORFⅠ的功能及其对核盘菌的影响 |
| 2.4.1 SsNSRV-1 P1 蛋白的结构和功能预测 |
| 2.4.2 核盘菌ORFⅠ超表达转化子与1980差异表达基因概述 |
| 2.4.3 核盘菌ORF I超表达转化子差异表达基因GO富集分析 |
| 2.4.4 核盘菌ORF I超表达转化子差异表达基因KEGG富集分析 |
| 2.4.5 核盘菌ORFⅠ超表达转化子与1980显着差异表达基因 |
| 2.4.6 核盘菌ORFⅠ超表达转化子中的分泌蛋白和致病相关蛋白 |
| 2.5 基因ORF Ⅱ的功能及其对核盘菌的影响 |
| 2.5.1 SsNSRV-1N蛋白的结构和功能分析 |
| 2.5.2 核盘菌ORF Ⅱ超表达转化子与1980差异表达基因概述 |
| 2.5.3 核盘菌ORF Ⅱ超表达转化子差异表达基因GO富集分析 |
| 2.5.4 核盘菌ORF Ⅱ超表达转化子差异表达基因KEGG富集分析 |
| 2.5.5 核盘菌ORF Ⅱ超表达转化子显着差异表达基因 |
| 2.6 基因ORF Ⅲ的功能及其对核盘菌的影响 |
| 2.6.1 SsNSRV-1 P3 的蛋白结构和功能预测 |
| 2.6.2 核盘菌ORF Ⅲ超表达转化子与1980 差异表达基因概述 |
| 2.6.3 核盘菌ORF Ⅲ超表达转化子差异表达基因GO富集分析 |
| 2.6.4 核盘菌ORF Ⅲ超表达转化子差异表达基因KEGG富集分析 |
| 2.6.5 核盘菌ORF Ⅲ超表达转化子显着差异表达基因 |
| 2.7 基因ORF Ⅳ的功能及其对核盘菌的影响 |
| 2.7.1 SsNSRV-1 P4 蛋白的结构和功能预测 |
| 2.7.2 核盘菌ORF Ⅳ超表达转化子与1980差异表达基因概述 |
| 2.7.3 核盘菌ORF Ⅳ超表达转化子差异表达基因GO富集分析 |
| 2.7.4 核盘菌ORF Ⅳ超表达转化子差异表达基因KEGG富集分析 |
| 2.7.5 核盘菌ORF Ⅳ超表达转化子显着差异表达基因 |
| 2.8 基因ORF Ⅵ的功能及其对核盘菌的影响 |
| 2.8.1 SsNSRV-1 P6 蛋白的结构和功能预测 |
| 2.8.2 核盘菌ORF Ⅵ超表达转化子与1980差异表达基因概述 |
| 2.8.3 核盘菌ORF Ⅵ超表达转化子差异表达基因GO富集分析 |
| 2.8.4 核盘菌ORF Ⅵ超表达转化子差异表达基因KEGG富集分析 |
| 2.8.5 核盘菌ORF Ⅵ超表达转化子显着差异表达基因 |
| 2.9 核盘菌病毒基因超表达转化子共有差异基因分析 |
| 3.小结与讨论 |
| 3.1 小结 |
| 3.2 讨论 |
| 3.2.1 病毒ORFⅠ可能参与病毒粒子的形成 |
| 3.2.2 病毒SsNSRV-1 导致核盘菌致病力衰退的机制 |
| 3.2.3 病毒SsNSRV-1 影响核盘菌的转录调控 |
| 3.2.4 病毒SsNSRV-1 调控核盘菌的跨膜运输 |
| 3.2.5 病毒SsNSRV-1 调控核盘菌生长发育 |
| 3.2.6 病毒SsNSRV-1 调控核盘菌的信号传导途径 |
| 3.2.7 病毒SsNSRV-1 调控核盘菌蛋白质合成和降解 |
| 3.2.8 病毒SsNSRV-1 调控核盘菌自噬 |
| 第五章 真菌病毒SsNSRV-1 基因表达对寄主代谢的影响 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 研究材料 |
| 1.2 主要试剂及仪器 |
| 1.3 研究方法 |
| 1.3.1 代谢组分析菌株的培养 |
| 1.3.2 代谢样品的提取 |
| 1.3.3 LC-MS分析条件 |
| 1.3.4 LC-MS数据处理 |
| 2.结果分析 |
| 2.1 代谢数据预处理 |
| 2.2 病毒核盘菌ORFⅠ对核盘菌代谢的影响 |
| 2.2.1 核盘菌ORFⅠ超表达转化子代谢差异分析 |
| 2.2.2 代谢组数据统计分析 |
| 2.2.3 核盘菌ORFⅠ超表达转化子显着差异物鉴定 |
| 2.3 病毒ORF Ⅱ对核盘菌代谢的影响 |
| 2.3.1 核盘菌ORF Ⅱ超表达转化子代谢差异分析 |
| 2.3.2 核盘菌ORF Ⅱ超表达转化子代谢组数据统计分析 |
| 2.3.3 核盘菌ORF Ⅱ超表达转化子显着差异物鉴定 |
| 2.4 病毒ORF Ⅲ对核盘菌代谢的影响 |
| 2.4.1 核盘菌ORF Ⅲ超表达转化子代谢差异分析 |
| 2.4.2 核盘菌ORF Ⅲ超表达转化子代谢组数据统计分析 |
| 2.4.3 核盘菌ORF Ⅲ超表达转化子显着差异物鉴定 |
| 2.5 病毒ORF Ⅳ对核盘菌代谢的影响 |
| 2.5.1 核盘菌ORF Ⅳ超表达转化子代谢差异分析 |
| 2.5.2 代谢组数据统计分析 |
| 2.5.3 核盘菌ORF Ⅳ超表达转化子显着差异物鉴定 |
| 2.6 病毒ORF Ⅵ对核盘菌代谢的影响 |
| 2.6.1 核盘菌ORF Ⅵ超表达转化子代谢差异分析 |
| 2.6.2 核盘菌ORF Ⅵ超表达转化子代谢组数据统计分析 |
| 2.6.3 核盘菌ORF Ⅵ超表达转化子显着差异物鉴定 |
| 2.7 核盘菌ORF Ⅰ、ORF Ⅱ和 ORF Ⅲ超表达转化子共有差异代谢物 |
| 3.小结与讨论 |
| 3.1 小结 |
| 3.2 讨论 |
| 全文总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1.论文中使用的引物 |
| 附录2.附图 |
| 附图1.转录组测序样品质量评估 |
| 附图2.转录组测序样品平均错误率 |
| 附图3.转录组测序样品碱基含量分布 |
| 附图4.转录组测序样品比对基因组质量分析 |
| 附录3.附表 |
| 附表1.核盘菌中已研究的部分弱毒相关病毒 |
| 附表2.核盘菌ORFⅠ超表达转化子与1980显着差异表达基因 |
| 附表3.核盘菌ORF Ⅱ超表达转化子与1980显着差异表达基因 |
| 附表4.核盘菌ORF Ⅲ超表达转化子与1980 显着差异表达基因 |
| 附表5.核盘菌ORF Ⅳ超表达转化子与1980显着差异表达基因 |
| 附表6.核盘菌ORF Ⅵ超表达转化子与1980显着差异表达基因 |
| 附表7.核盘菌ORFⅠ超表达转化子与1980显着差异代谢物 |
| 附表8.核盘菌ORF Ⅱ超表达转化子与1980显着差异代谢物 |
| 附表9.核盘菌ORF Ⅲ超表达转化子与1980 显着差异代谢物 |
| 附表10.核盘菌ORF Ⅳ超表达转化子与1980差异代谢物 |
| 附表11.核盘菌ORF Ⅵ超表达转化子与1980差异代谢物 |
| 附录4.已发表的论文及参与的会议 |
| 致谢 |
（7）澳大利亚核盘菌病毒多样性及低毒菌株SX276中RNA病毒分子特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 核盘菌的危害及菌核病防治 |
| 1.1 核盘菌及菌核病 |
| 1.1.1 核盘菌的生物学特性 |
| 1.1.2 核盘菌的危害及侵染循环 |
| 1.2 核盘菌的致病机理 |
| 1.2.1 水解酶类 |
| 1.2.2 草酸 |
| 1.2.3 侵染垫 |
| 1.2.4 分泌蛋白参与核盘菌侵染过程 |
| 1.2.5 其他致病相关基因 |
| 1.3 菌核病的防治方法 |
| 1.3.1 抗病育种 |
| 1.3.2 农业防治 |
| 1.3.3 化学防治 |
| 1.3.4 生物防治 |
| 2 真菌病毒的研究进展 |
| 2.1 真菌病毒的分类 |
| 2.2 真菌病毒的传播特性 |
| 2.2.1 水平传播 |
| 2.2.2 垂直传播 |
| 2.2.3 体外传播及介体传播 |
| 2.3 真菌病毒的生防潜力 |
| 2.4 宏病毒组学在真菌病毒多样性分析中的应用 |
| 2.5 真菌病毒的复合侵染及其相互作用 |
| 2.5.1 真菌病毒的复合侵染 |
| 2.5.2 真菌病毒复合侵染广泛存在的潜在原因 |
| 2.5.3 真菌病毒的相互作用 |
| 3 核盘菌病毒研究 |
| 3.1 核盘菌中病毒多样性 |
| 3.2 核盘菌与真菌病毒间的相互作用 |
| 3.3 本研究中涉及的主要病毒类群 |
| 3.3.1 弹状病毒科 |
| 3.3.2 内源RNA病毒科 |
| 4 本研究的目的及意义 |
| 第二章 澳大利亚核盘菌病毒多样性分析 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 研究材料 |
| 2.2 核盘菌菌株的分离 |
| 2.3 核盘菌菌株生长速度的测定以及菌落形态的观察 |
| 2.4 核盘菌菌株致病力的测定 |
| 2.5 核盘菌菌株中dsRNA的提取及检测 |
| 2.6 核盘菌总RNA的提取 |
| 2.7 测序菌株混合样品质检 |
| 2.8 测序流程以及测序结果的分析 |
| 2.9 测序得到的病毒相关序列遗传进化分析 |
| 2.10 根据测序得到的序列设计特异性引物验证病毒的存在 |
| 3 结果分析 |
| 3.1 核盘菌菌株生物学特性的观察 |
| 3.1.1 核盘菌菌株菌落形态的观察及生长速度的测定 |
| 3.1.2 核盘菌菌株致病力的测定 |
| 3.2 核盘菌菌株中含有丰富的dsRNA |
| 3.3 宏转录组测序结果的分析 |
| 3.3.1 与全病毒和双分病毒相关的病毒序列信息及进化分析 |
| 3.3.2 与灰葡萄孢双节段病毒及多聚真菌病毒相关的病毒序列信息及进化分析 |
| 3.3.3 与减病毒相关的病毒序列信息及进化分析 |
| 3.3.4 与内源RNA病毒相关的病毒序列信息及进化分析 |
| 3.3.5 与线粒体病毒及灰葡萄孢欧尔密病毒相关的病毒序列信息及进化分析 |
| 3.3.6 与芜菁花叶病毒及番茄丛矮病毒相关的病毒序列信息及进化分析 |
| 3.3.7 负链RNA病毒的病毒序列信息及及进化分析 |
| 3.3.8 与真菌双生病毒相关的病毒序列信息 |
| 4 结论与讨论 |
| 第三章 核盘菌低毒菌株SX276中病毒种类鉴定 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 研究材料 |
| 2.2 核盘菌菌株SX276生物学特性观察 |
| 2.3 菌株SX276的dsRNA的提取 |
| 2.4 菌株SX276总RNA的提取及质检 |
| 2.5 测序流程以及测序结果的分析 |
| 2.6 病毒序列的验证 |
| 2.7 病毒全长序列的克隆 |
| 2.7.1 克隆末端所需要的引物 |
| 2.7.2 加接头连接反应 |
| 2.7.3 加完接头后的RNA处理 |
| 2.7.4 反转录 |
| 2.8 PCR产物连接载体测序 |
| 2.9 病毒的基因组结构分析及多重比对与进化分析 |
| 2.10 病毒粒子的提取 |
| 2.11 PEG介导的病毒粒子转染 |
| 2.12 原生质体再生脱除真菌病毒 |
| 3 结果分析 |
| 3.1 核盘菌菌株SX276的生物学特性 |
| 3.2 菌株SX276被9种不同的真菌病毒复合侵染 |
| 3.3 SsHV1/SX276和SsBV3/SX276 的基因组结构及其对寄主的影响 |
| 3.4 欧尔密病毒SsOV4/SX276和SsOV5 的分子特性及其对寄主的影响 |
| 3.4.1 欧尔密病毒SsOV4/SX276和SsOV5 的分子特性 |
| 3.4.2 SsOV4/SX276及SsOV5 的水平传播特性 |
| 3.4.3 SsOV4/SX276及SsOV5 对寄主生物学表型的影响 |
| 3.5 隶属于芜菁花叶病毒目的SsMTV2、SsDFV3 的分子特性 |
| 3.6 新型RNA病毒SsMAV1 的分子特性 |
| 4 结论与讨论 |
| 第四章 弹状病毒SsRhV1的分子特性及生物学特性 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 研究材料 |
| 2.2 核盘菌菌株生物学特性的观察 |
| 2.3 核盘菌菌株dsRNA的提取 |
| 2.4 核盘菌菌株总RNA的提取及病毒检测 |
| 2.5 病毒全长序列的克隆 |
| 2.6 病毒的基因组结构分析及多重比对与进化分析 |
| 2.7 病毒粒子的提取及观察 |
| 2.8 核盘菌原生质体再生 |
| 2.9 弹状病毒SsRhV1基因的表达模式 |
| 2.9.1 含有Poly(A)的mRNA分离与富集 |
| 2.9.2 基因的3?与5?RACE |
| 2.10 病毒的基因组结构分析及多重比对与进化分析 |
| 3 结果分析 |
| 3.1 弹状病毒SsRhV1基因组特性 |
| 3.2 弹状病毒SsRhV1的转录调控信号及基因表达模式 |
| 3.3 弹状病毒SsRhV1的系统发育分析 |
| 3.4 SsRhV1与其他弹状病毒代表种基因组结构比较分析 |
| 3.5 弹状病毒SsRhV1的病毒粒子特性观察 |
| 3.6 弹状病毒SsRhV1对寄主生物学特性潜在的影响 |
| 4 结论与讨论 |
| 第五章 内源RNA病毒SsEV3 的分子特性及生物学特性 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 研究材料 |
| 2.2 核盘菌生物学特性的分析 |
| 2.3 总RNA的提取及病毒检测 |
| 2.4 核盘菌内源RNA病毒SsEV3 全长c DNA序列的克隆 |
| 2.5 SsEV3基因组结构分析及遗传聚类分析 |
| 2.6 核盘菌原生质体制备及再生 |
| 2.7 对峙培养进行病毒水平传播能力测定 |
| 3 结果分析 |
| 3.1 内源RNA病毒SsEV3 基因组特性分析 |
| 3.2 内源RNA病毒SsEV3 的遗传进化分析 |
| 3.3 仅含有SsEV3的核盘菌原生质体再生菌株的获得 |
| 3.4 SsEV3与核盘菌低毒特性相关 |
| 3.5 SsEV3导致寄主产菌核能力下降 |
| 3.6 SsEV3导致寄主降解酸性物质能力下降 |
| 3.7 SsEV3引起核盘菌抵抗非生物胁迫的能力下降 |
| 3.8 SsEV3导致寄主不能形成侵染垫 |
| 4 结论与讨论 |
| 第六章 结论与展望 |
| 1 全文结论与讨论 |
| 2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 文中附表 |
| 附录2 在读期间研究成果 |
| 致谢 |
（8）SLCCNV和MNSV侵染性克隆的构建及致病因子鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 侵染我国葫芦科作物病毒种类 |
| 1.2 SLCCNV研究背景 |
| 1.2.1 双生病毒的发生与为害 |
| 1.2.2 双生病毒分类及基因组结构 |
| 1.2.3 Begomovirus基因组特征及为害 |
| 1.2.4 SLCCNV生物学特征及研究现状 |
| 1.3 MNSV研究背景 |
| 1.3.1 分类地位、特性与分布 |
| 1.3.2 病毒编码的基因及其致病性 |
| 1.3.3 病毒在细胞间的移动 |
| 1.3.4 病毒传播因素 |
| 1.3.5 植物抗病毒研究 |
| 1.3.6 寄主植物响应MNSV入侵的应答反应 |
| 1.4 侵染性克隆载体的构建及应用 |
| 1.4.1 植物病毒侵染性克隆载体构建 |
| 1.4.2 植物病毒侵染性克隆的应用 |
| 1.5 病毒编码的沉默抑制子 |
| 1.5.1 基因沉默 |
| 1.5.2 病毒编码的RNA沉默抑制子及其作用原理 |
| 1.6 本研究的意义及内容 |
| 第二章 SLCCNV侵染性克隆的构建 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 田间甜瓜病叶检测 |
| 2.3.2 基因组结构 |
| 2.3.3 基因重组分析 |
| 2.3.4 系统进化分析 |
| 2.3.5 侵染性克隆致病性鉴定及烟粉虱传染 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 AC5是SLCCNV编码的致病因子 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 AC5系统进化分析 |
| 3.3.2 AC5的C端激发过敏性坏死反应 |
| 3.3.3 AC5是SLCCNV的致病因子 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 SLCCNV AC5沉默抑制功能及其沉默机制 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.2 方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 AC5抑制局部沉默 |
| 4.3.2 AC5抑制沉默信号的系统运输 |
| 4.3.3 AC5的C端决定沉默活性 |
| 4.3.4 AC5不抑制双链dsRNA沉默 |
| 4.3.5 AC5沉默在蛋白水平起作用 |
| 4.3.6 核定位信号与PTGS关系 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 携带GFP的 MNSV侵染性克隆重组载体构建 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 材料 |
| 5.2.2 方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 5'端和3'端序列分析 |
| 5.3.2 MNSV基因组序列及编码蛋白 |
| 5.3.3 MNSV基因组聚类分析 |
| 5.3.4 侵染性克隆载体的构建 |
| 5.3.5 携带GFP的 MNSV侵染性克隆重组载体 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 MNSV p42与寄主因子互作筛选 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 材料 |
| 6.2.2 方法 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 p42基因致病力鉴定 |
| 6.3.2 p42突变体致病力分析 |
| 6.3.3 整株甜瓜cDNA文库评价 |
| 6.3.4 p42与寄主因子互作筛选 |
| 6.4 讨论 |
| 第七章 全文结论及后续研究设想 |
| 7.1 全文结论 |
| 7.2 后续研究设想 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ:部分载体图谱 |
| 附录Ⅱ:部分试剂 |
| 附录Ⅲ:本研究所用引物 |
| 附录Ⅳ:作者简介 |
| 附录Ⅴ:攻读博士研究生阶段的成绩 |
| 致谢 |
（9）小麦黄花叶病毒CP与寄主FtsH2互作研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 小麦黄花叶病毒的研究进展 |
| 1.1.1 小麦黄花叶病发生危害及防控 |
| 1.1.2 WYMV分子生物学研究 |
| 1.2 FtsH2基因研究 |
| 1.3 研究植物病毒与寄主互作的主要方法 |
| 2 引言 |
| 3 材料与方法 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 样品采集 |
| 3.1.2 所用试剂 |
| 3.1.3 菌株和载体 |
| 3.1.4 引物 |
| 3.1.4.1 用于酵母双杂交的引物 |
| 3.1.4.2 用于BiFC及共定位的引物 |
| 3.1.4.3 用于实时荧光定量的引物 |
| 3.1.4.4 用于沉默基因的引物 |
| 3.2 TaFtsH2基因克隆及序列比对分析 |
| 3.2.1 小麦总RNA的提取 |
| 3.2.2 cDNA的获得 |
| 3.2.2.1 gDNA去除反应 |
| 3.2.2.2 反转录反应 |
| 3.2.3 小麦TaFtsH2基因的获得 |
| 3.2.3.1 TaFtsH2基因的扩增 |
| 3.2.3.2 PCR产物回收 |
| 3.2.4 将PCR产物连接和转化 |
| 3.2.4.1 PCR产物连接pMD18-T载体 |
| 3.2.4.2 连接产物转化感受态细胞DH5α |
| 3.2.4.3 PCR检测 |
| 3.2.5 电泳检测并测序 |
| 3.2.6 小麦TaFtsH2蛋白功能域预测分析及同源性比对 |
| 3.3 WYMV CP与小麦TaFtsH2蛋白互作验证 |
| 3.3.1 酵母双杂交验证WYMV CP与小麦TaFtsH2蛋白互作 |
| 3.3.1.1 酵母双杂交的载体构建 |
| 3.3.1.2 酵母感受态的制备(PEG/LiAc法) |
| 3.3.1.3 重组质粒毒性和自激活活性检测 |
| 3.3.1.4 酵母双杂交验证蛋白互作 |
| 3.3.2 互作功能域确定 |
| 3.3.3 双分子荧光互补(BiFC)验证蛋白互作 |
| 3.3.3.1 双分子荧光互补载体构建 |
| 3.3.3.2 农杆菌转化、浸润烟草 |
| 3.4 小麦TaFtsH2与WYMV编码的其他蛋白的互作 |
| 3.5 共定位分析 |
| 3.5.1 共定位载体构建 |
| 3.5.2 农杆菌转化、浸润烟草 |
| 3.6 WYMV侵染对小麦TaFtsH2基因表达的影响 |
| 3.6.1 RNA的提取、反转录 |
| 3.6.2 小麦TaFtsH2基因相对表达量分析 |
| 3.6.3 不同病叶病毒表达量分析 |
| 3.7 烟草NbFtsH2基因的克隆与序列分析 |
| 3.7.1 烟草WbFtsH2基因的克隆 |
| 3.7.2 烟草NbFtsH2蛋白与小麦TaFtsH2蛋白序列比对分析 |
| 3.7.3 酵母双杂交验证烟草NbFtsH2蛋白与TuMV CP互作 |
| 3.8 NbFtsH2基因沉默对TuMV侵染的影响 |
| 3.8.1 TRV2- NbFtsH2干扰载体的构建 |
| 3.8.2 农杆菌转化、浸润烟草 |
| 3.8.3 沉默效率的计算和表型观察 |
| 3.8.4 病毒接种 |
| 3.8.5 Western Blot检测 |
| 3.8.5.1 烟草叶片蛋白提取 |
| 3.8.5.2 Western Blot检测GFP表达量 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 小麦TaFtsH2蛋白序列分析 |
| 4.1.1 小麦TaFtsH2基因的克隆 |
| 4.1.2 TaFtsH2蛋白功能域预测分析 |
| 4.1.3 FtsH2序列同源性分析 |
| 4.2 酵母双杂交结果分析 |
| 4.2.1 小麦TaFtsH2基因的AD重组质粒的构建 |
| 4.2.2 酵母双杂交验证小麦TaFtsH2与WYMV CP互作 |
| 4.2.3 小麦TaFtsH2与WYMV CP互作功能域的确定 |
| 4.2.3.1 小麦TaFtsH2与WYMV CP互作基序分析 |
| 4.2.3.2 WYMV CP与小麦TaFtsH2互作基序分析 |
| 4.3 BiFC结果分析 |
| 4.3.1 BiFC载体构建 |
| 4.3.2 BiFC验证小麦TaFtsH2与WYMV CP互作 |
| 4.4 小麦TaFtsH2与WYMV编码7K、14K、P1、P2互作分析 |
| 4.5 CP与TaFtsH2共定位分析 |
| 4.6 WYMV侵染对小麦TaFtsH2基因表达的影响 |
| 4.7 烟草NbFtsH2基因的克隆与序列分析 |
| 4.8 烟草NbFtsH2蛋白与TuMV CP互作 |
| 4.8.1 pGADT7-NbFtsH2与pGBKT7-CPTuMv载体的构建 |
| 4.8.2 酵母双杂交验证NbFtsH2与TuMV CP互作 |
| 4.9 NbFtsH2基因在本氏烟中的功能研究 |
| 4.9.1 TRV2-NbFtsH2干扰载体的构建 |
| 4.9.2 NbFtsH2基因沉默效率和表型 |
| 4.9.3 NbFtsH2基因沉默后对TuMV侵染的影响 |
| 5 结论与讨论 |
| 5.1 WYMV CP与小麦FtsH2互作 |
| 5.2 WYMV侵染对TaFtsH2基因表达的影响 |
| 5.3 FtsH2沉默导致褪绿黄花症状,抑制病毒的侵染 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
（10）薯蓣褪绿坏死花叶病毒的普通生物学及分子生物学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 马铃薯Y病毒科及相关背景概述 |
| 1.1 马铃薯Y病毒科简介 |
| 1.2 Potyvirus属蛋白功能及相关研究进展 |
| 1.3 Potyvirus属病毒的翻译与复制 |
| 1.3.1 病毒的翻译过程 |
| 1.3.2 病毒的转录复制过程 |
| 1.4 Potyviridae科不同种的分类标准 |
| 1.5 Macluravirus病毒属及薯蓣褪绿坏死花叶病毒(Yam chlorotic necrotic mosaic virus,YCNMV)概述 |
| 2 植物病毒病的主要检测方法概述 |
| 2.1 基于指示植物的生物学鉴定方法 |
| 2.2 基于电镜观察植物组织切片的方法 |
| 2.3 基于血清学的鉴定方法 |
| 2.4 基于分子生物学的检测方法 |
| 2.5 部分新兴植物病毒检测技术概述 |
| 2.5.1 肽质量指纹谱(Peptide Mass Fingerprinting,PMF)技术 |
| 2.5.2 下一代测序技术(Next generation sequencing,NGS) |
| 3 植物病毒的种群遗传结构及多样性研究进展概述 |
| 3.1 病毒的“准种结构” |
| 3.2 植物RNA病毒的种群变异概述 |
| 3.3 植物RNA病毒分子遗传多样性的研究方法 |
| 3.3.1 同源性分析 |
| 3.3.2 病毒的分子系统发生 |
| 3.3.3 病毒重组分析 |
| 3.3.4 病毒的选择压力分析 |
| 4 植物RNA病毒侵染性克隆 |
| 4.1 侵染性克隆的类型 |
| 4.1.1 侵染性cDNA概述 |
| 4.1.2 侵染性体外转录物概述 |
| 4.2 影响侵染性克隆构建的因素 |
| 4.3 已构建的Potyviridae科侵染性克隆及其应用概述 |
| 4.4 侵染性克隆应用与展望 |
| 5 运动蛋白简介与定位 |
| 5.1 病毒在植物体内的运动过程(以Potyvirus属病毒为例) |
| 5.2 运动蛋白概述 |
| 5.3 运动蛋白的分类 |
| 5.4 Potyvirus属病毒运动蛋白概述 |
| 5.5 主要运动蛋白功能 |
| 5.6 蛋白的亚细胞定位 |
| 6 本研究的目的与意义 |
| 第二章 YCNMV普通生物学研究及全基因组序列测定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒来源及其他材料来源 |
| 1.2 载体与菌株来源 |
| 1.3 其他分子生物学试剂 |
| 1.4 引物设计 |
| 1.5 仪器设备 |
| 1.6 病毒粒子的电镜观察及负染、切片方法 |
| 1.7 病毒粒子的纯化方法 |
| 1.8 病毒接种方法 |
| 1.8.1 磨擦接种 |
| 1.8.2 浸润接种 |
| 1.8.3 蚜传接种 |
| 1.9 YCNMV全长序列的获得 |
| 1.9.1 RNA提取用设备的无RNase处理 |
| 1.9.2 植物总RNA的提取 |
| 1.9.3 cDNA全长序列的获得 |
| 1.9.4 cDNA样品与接头引物的连接 |
| 1.9.5 5'RACE的PCR条件及体系 |
| 1.9.6 扩增片段的纯化 |
| 1.9.7 感受态细胞的制备 |
| 1.9.8 目的片段的连接与转化 |
| 1.9.9 目的片段的验证及测序 |
| 1.9.10 目的质粒的抽提 |
| 1.9.11 测序结果分析与序列拼接 |
| 1.9.12 系统进化树的构建 |
| 1.10 ID-ELISA法检测YCNMV与部分Potyviridae科病毒之间的血清学关系 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 YCNMV感病植株症状 |
| 2.2 YCNMV病毒粒子及感病叶片超薄切片电子显微镜观察 |
| 2.3 YCNMV病毒的接种实验 |
| 2.4 薯蓣总RNA的提取 |
| 2.5 YCNMV全基因组序列的获得 |
| 2.5.1 3'-RACE |
| 2.5.2 5'-RACE |
| 2.5.3 其他基因序列的获得 |
| 2.5.4 YCNMV基因组序列的分析 |
| 2.6 YCNMV与部分Potyviridae科成员多聚蛋白系统进化树 |
| 2.7 Anti-CPYCNMV抗血清与Potyviridae科其他几种病毒的血清学关系鉴定 |
| 3 讨论 |
| 第三章 YCNMV检测体系的建立及其应用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒来源 |
| 1.2 载体、菌株及抗体来源 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 其他实验材料 |
| 1.5 血清学检测体系的建立 |
| 1.5.1 基因的克隆及原核表达载体的构建 |
| 1.5.2 原核表达载体的转化及鉴定 |
| 1.5.3 菌株保储 |
| 1.5.4 蛋白诱导表达体系的优化 |
| 1.5.5 SDS-PAGE电泳检测诱导表达产物 |
| 1.5.6 大量蛋白诱导表达体系的建立 |
| 1.5.7 融合蛋白的纯化(以下步骤于4℃冰箱内完成) |
| 1.5.8 柱子的回收 |
| 1.5.9 蛋白浓度的检测 |
| 1.5.10 Anti-CP_(YCNMV)抗血清的制备 |
| 1.5.11 基于Anti-CP_(YCNMV)抗血清的检测体系的建立及抗血清效价检测 |
| 1.5.12 Western blot检测抗体特异性及感病植株内病毒 |
| 1.6 基于RT-PCR检测体系的建立 |
| 1.6.1 简并引物的设计 |
| 1.6.2 特异性检测引物的建立 |
| 1.7 qRT-PCR检测体系的建立以及YCNMV主要寄生部位的鉴定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 cp基因原核表达载体的构建 |
| 2.1.1 cp基因的克隆 |
| 2.1.2 构建到pET30a原核表达载体内的cp基因的序列分析 |
| 2.1.3 CP融合蛋白的溶解性分析及诱导表达条件优化 |
| 2.1.4 Anti-CP_(YCNMV)抗血清的制备 |
| 2.1.5 Dot-ELISA检测体系的建立 |
| 2.1.6 ID-ELISA检测体系的建立及薯蓣样品的检测鉴定 |
| 2.1.7 ID-ELISA在样品检测筛选中的应用 |
| 2.1.8 Western blot检测抗血清特异性及感病植株病毒 |
| 2.2 RT-PCR检测体系的建立 |
| 2.2.1 RT-PCR简并引物的设计及应用 |
| 2.2.2 检测用特异引物设计 |
| 2.3 qRT-PCR检测体系的建立以及YCNMV主要寄生部位的鉴定 |
| 3 讨论 |
| 第四章 YCNMV分子遗传多样性 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒毒源 |
| 1.2 菌株及载体 |
| 1.3 其他分子生物学试剂及引物 |
| 1.4 各分离物及参考序列信息 |
| 1.5 序列的生物信息学分析 |
| 1.5.1 测序片段的拼接 |
| 1.5.2 YCNMV cp基因及3'-UTR核苷酸序列的比对 |
| 1.5.3 部分Macluravirus属成员cp基因的系统进化树构建 |
| 1.5.4 序列重组分析 |
| 1.5.5 YCNMV种群cp核苷酸位点多态性分析 |
| 1.5.6 YCNMV种群内的选择压力位点分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 YCNMV cp基因及3'-UTR核苷酸序列的比对 |
| 2.2 YCNMV不同分离物与其他柘橙属成员CP氨基酸序列、cp基因核苷酸序列及3 '-UTR核苷酸序列系统进化树的构建 |
| 2.3 YCNMV种群cp核苷酸位点多态性分析 |
| 2.4 YCNMV全基因组序列重组分析 |
| 2.5 YCNMV种群内的选择压力位点分析 |
| 3 讨论 |
| 第五章 YCNMV侵染性克隆的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒毒源 |
| 1.2 菌株及载体 |
| 1.3 其他分子生物学试剂 |
| 1.4 引物设计 |
| 1.5 实验方案设计及流程侵染性克隆构建示意图 |
| 1.6 YCNMV各基因片段的获得 |
| 1.6.1 YCNMV各基因片段的亚克隆 |
| 1.6.2 Over-lap PCR反应及融合片段的克隆测序 |
| 1.6.3 pSKn质粒骨架的获得 |
| 1.7 侵染性克隆中间载体的获得 |
| 1.8 侵染性克隆的获得 |
| 1.8.1 中间载体的重新线性化 |
| 1.8.2 线性化中间载体与其他目的片段的Infusion连接 |
| 1.9 pSKycnmv侵染性克隆体外转录物制备与5'加帽反应 |
| 1.9.1 pSKycnmv质粒的线性化 |
| 1.9.2 pSKycnmv的体外转录及5’加帽反应 |
| 1.9.3 转录产物的去DNA模板处理 |
| 1.10 侵染性转录物的接种 |
| 1.11 接种植株的观察与检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 质粒的抽提 |
| 2.2 线性化pSKn质粒及其他各片段的获得 |
| 2.3 连接转化产物菌落PCR验证结果 |
| 2.4 菌落PCR阳性克隆质粒的抽提及单酶切、双酶切验证 |
| 2.5 pSKycnmv-B29全基因组测序结果 |
| 2.6 pSKycnmv-B29的体外转录及加帽 |
| 2.7 体外转录产物的定量检测 |
| 2.8 T7侵染性转录产物的接种实验 |
| 3 讨论 |
| 第六章 YCNMV疑似运动相关蛋白的初步亚细胞定位 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒来源 |
| 1.2 载体、菌株及抗体来源 |
| 1.3 其他实验材料 |
| 1.4 引物设计 |
| 1.5 仪器设备 |
| 1.6 实验方法 |
| 1.6.1 构建的疑似运动蛋白真核表达载体示意图 |
| 1.6.2 常规PCR、PCR产物纯化、质粒酶切、连接及亚克隆过程 |
| 1.6.3 ci基因的Infusion连接体系 |
| 1.6.4 农杆菌GV3101感受态细胞的制备 |
| 1.6.5 农杆菌的转化 |
| 1.6.6 农杆菌介导的瞬时表达浸润接种 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 各疑似运动蛋白片段的PCR扩增 |
| 2.2 各疑似运动蛋白的亚细胞定位 |
| 3 讨论 |
| 第七章 结论与进一步研究建议 |
| 附录 |
| 1 YCNMV全基因组序列 |
| 2 cp基因核苷酸序列与参考序列比对 |
| 3 CP蛋白氨基酸序列与参考序列比对 |
| 4 PSKYCNMV-B29侵染性克隆序列与参考序列比对结果 |
| 5 本文涉及病毒中文名、英文名及缩写列表 |
| 6 论文中所涉及化学试剂缩写及中文名列表 |
| 7 论文中涉及YCNMV分离物采样地及索引号,CYNMV分离物索引号汇总 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士研究生期间发表文章 |
四、大麦黄花叶病毒属成员UTR系统进化树分析及编码蛋白跨膜结构推测（论文参考文献）
- [1]侵染猕猴桃的负义RNA病毒的鉴定及编码蛋白的互作研究[D]. 王雁翔. 华中农业大学, 2021(02)
- [2]黑尾叶蝉感染水稻矮缩病毒后唾液腺转录组变化分析及其两种RNA病毒基因组结构分析[D]. 贾文茜. 浙江大学, 2021(01)
- [3]基于RNA-seq的水稻新病毒RCDaV的鉴定及水稻响应RBSDV侵染的lncRNA-mRNA调控网络研究[D]. 张天则. 浙江大学, 2021(01)
- [4]酵母双杂交筛选与小麦黄花叶病毒P2互作的寄主因子及其功能研究[D]. 韩晓蕾. 烟台大学, 2021
- [5]酵母双杂交筛选与小麦黄花叶病毒P2互作的寄主因子[J]. 韩晓蕾,高仕祺,张帆,羊健,刘芃,姜鸿明,李林志. 浙江农业学报, 2021(03)
- [6]SsNSRV-1基因功能及其与核盘菌互作机制研究[D]. 高知枭. 华中农业大学, 2020
- [7]澳大利亚核盘菌病毒多样性及低毒菌株SX276中RNA病毒分子特性研究[D]. 穆凡. 华中农业大学, 2020
- [8]SLCCNV和MNSV侵染性克隆的构建及致病因子鉴定[D]. 吴会杰. 华中农业大学, 2019
- [9]小麦黄花叶病毒CP与寄主FtsH2互作研究[D]. 梁乐乐. 河南农业大学, 2019(04)
- [10]薯蓣褪绿坏死花叶病毒的普通生物学及分子生物学研究[D]. 张鹏远. 云南大学, 2016(05)