噬菌体表面展示技术筛选乙型肝炎病毒Pre-S1蛋白结合蛋白基因

一、噬菌体表面展示技术筛选乙型肝炎病毒前S1蛋白结合蛋白基因（论文文献综述）

纪冬,成军,韩萍,邵清,陈国凤^[1]（2012）在《噬菌体展示技术在HBV前-S1蛋白反式激活基因1启动子DNA的结合蛋白筛选中的应用》文中指出目的应用噬菌体展示技术筛选HBV前-S1蛋白反式激活基因1（PS1TP1）的启动子DNA结合蛋白,进一步阐述PS1TP1在慢性乙型肝炎发病机制中的作用。方法根据GenBank中的PS1TP1启动子DNA序列设计引物,运用PCR技术以人基因组DNA为模板,扩增获得PS1TP1启动子的DNA片段,并通过亚克隆方法构建真核报告载体pCAT3-PS1TP1p后转染HepG2细胞系,采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测转染细胞中氯霉素乙酰转移酶（CAT）的表达活性,以验证所获得的DNA片段具有启动子活性;将PS1TP1启动子DNA片段进行固相化,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行筛选,将所获得的噬斑裂解液进行PCR扩增,测序后进行DNA序列分析和同源性生物信息学搜索。结果 pCAT3-PS1TP1p瞬时转染的HepG2细胞中CAT表达活性是对照组（pCAT3-Basic空载体）的32.9倍,是pCAT3-promoter的4.2倍,提示所获得的DNA片段具有启动子活性;经4轮筛选共得到阳性克隆18个,经PCR扩增、测序,并经生物信息学分析后筛选出PS1TP1的启动子DNA结合蛋白编码基因共15个。结论 PCR扩增后所获得的PS1TP1启动子DNA片段具有顺式激活下游基因表达的作用,为研究PS1TP1启动子功能奠定了基础;噬菌体展示筛选结果提示PS1TP1可能参与了细胞周期调节、MAPK信号转导通路,并且有可能在辅助性T细胞亚群的发育和B细胞分化过程中发挥作用。

赵绪永^[2]（2009）在《传染性法氏囊病毒感染鸡胚成纤维细胞机理研究》文中研究指明传染性法氏囊病毒（infectious bursal disease virus,IBDV）是一种无囊膜双链RNA病毒,它所引起的鸡传染性法氏囊病（infectious bursal disease。IBD）是鸡的一种急性高度接触性致死性传染病,是造成养鸡业严重的经济损失的重要疫病之一。病毒受体在病毒吸附、侵入过程中起着极其重要的作用,病毒吸附是启动感染的第一步。研究IBDV的病毒受体,对于探明IBD发生的分子机制,阻断病毒对细胞的吸附和侵染过程,防止传染病的发生有重大意义。鸡胚成纤维细胞（chickenembryo fibroblast,CEF）也是IBDV的易感细胞,通常被用于IBDV的增殖。构建易感细胞的cDNA文库并利用阻断病毒感染的单克隆抗体筛选受体基因是病毒受体研究中最常用的方法。为了研究存在于CEF表面的IBDV受体或感染相关的分子,本研究首先构建了高质量的CEF细胞cDNA T7噬菌体表达文库和真核表达文库,并建立了制备高效电转化感受态细胞E.coli DH10B方法,用于真核表达文库的扩增;然后将生物素-链亲和素（biotin- streptavidin）用于免疫组化,建立了用于筛选阻断病毒感染的单克隆抗体的方法,并制备了阻断IBDV感染CEF的儿株单克隆抗体,为克隆存在于CEF的IBDV受体等感染相关的分子的基因,及揭示IBDV感染CEF的机理奠定了基础。1鸡胚成纤维细胞cDNA T7噬菌体表达文库的构建及鉴定培养CEF细胞,利用oligo（dT）-纤维素亲和层析法制备CEF细胞的mRNA,逆转录合成的cDNA双链,与T7 EcoRⅠ/HindⅢ载体臂定向连接,噬菌体包装,构建cDNA表达文库。测定文库的滴度和并用PCR进行重组子鉴定。将文库扩增并鉴定插入片段的长度及分布。结果显示,文库初始滴度为2.2×107 pfu/mL,扩增后文库的滴度为3.5×1010pfu/mL。插入片段的平均长度1.3kb,主要分布在0.4～3kb之间。说明成功构建的CEF细胞cDNA T7噬菌体表达文库,为进一步研究CEF细胞以及传染性法氏囊病毒（IBDV）受体研究奠定了基础。2鸡胚成纤维细胞cDNA真核表达文库的构建从CEF提取mRNA,反转录合成双链cDNA,与EcoRⅠ接头连接,经NotⅠ酶切后用spin column除去小于500 bp的片段,连接到预先经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切的真核表达质粒pAP3neo载体上,将重组质粒电转化DH10B,测定文库的容量大小并通过colony PCR鉴定插入cDNA片段的大小。经测定,原始文库滴度为2.7×106CFU/mL,重组率大于95%,重组子中插入片段的长度大部分在0.5～2.0kb之间,平均插入外源片段长度大于1.0 kb的约占85.7%。表明构建的文库能够充分满足克隆低丰度mRNA的要求,可以用于筛选IBDV在CEF表面的受体或感染相关分子。3高效电转化感受态细胞的制备为了能够制备高效的电转化感受态细胞,以用于cDNA真核表达文库的转化和扩增。通过对影响转化效率的参数:生长状况、洗液种类、最后细胞密度、电击强度等各个条件进行优化,建立了简单实用的高效电转化感受态细胞E.coli strain DH10B的制备方法,制备的感受态细胞的转化效率达2～6×109cfu/μgDNA,满足了文库转化、基因表达和克隆的特殊需要。同时也为其它大肠杆菌电转化感受态的制备提供了优化思路和借鉴。4阻断IBDV感染CEF的单克隆抗体筛选方法的建立为了制备阻断IBDV感染CEF的单克隆抗体,必须先建立一种有效的筛选单抗的方法。本研究基于免疫细胞化学的方法,采用Biotin-Streptavidin建立了感染阳性细胞数减少实验的方法,可用于阻断IBDV感染CEF的单克隆抗体的筛选。实验表明该方法简单、敏感、实用,是用来筛选阻断IBDV感染的mAb的较好的方法。该方法的建立制备阻断IBDV感染CEF的单克隆抗体奠定了基础,同时该系统的建立也为其它病毒受体的研究从方法学上提供借鉴。5阻断IBDV感染CEF的单克隆抗体的制备和鉴定制备阻断IBDV感染CEF的单克隆抗体,用来筛选或鉴定与单抗作用的受体蛋白或基因,是研究病毒受体的重要方法。CEF是IBDV易感细胞之一,该细胞表面有介导其感染的受体。采取不同方案免疫BALB/c小鼠,经三次免疫后采血测定抗体总效价和阻断感染的效果可见,采用长单层的CEF不加佐剂处理直接腹腔注射免疫的可获得高水平的阻断病毒感染的特异性抗体的产生。用病毒感染细胞数减少实验筛选到3株mAb能阻断IBDV感染CEF,其中一株阻断率达到84.5%。且阻断效率在一定范围内具有剂量依赖性。通过流式细胞仪进行结合实验标明该mAb所针对的表位存在丁CEF细胞表面,但是表达量非常低。推测该蛋白很可能是IBDV的受体之一或重要的感染相关分子,因为不能彻底的阻断感染可见另有其它受体或感染相关分子的存在,这与已报道的文献相符合。该单克隆抗体的制备这为揭示IBDV感染CEF的机理奠定了基础。

宋德光^[3]（2008）在《犊牛口腔黏膜上皮细胞cDNA文库的构建及其水泡性口炎病毒受体的筛选》文中指出水泡性口炎病毒（Vesicular Stomatitis Virus, VSV）是引起多种动物水泡性口炎的一种重要人兽共患病病原,属于弹状病毒科的成员。VSV对马、牛、猪特别易感,羊、山羊、多种野生动物和人均有易感性。水泡性口炎与口蹄疫、猪水泡病、猪水泡疹的临床症状十分相似,以口腔黏膜、舌、唇、乳头和蹄冠部上皮出现水泡为主要特征。VSV对不同动物致病性的共同特征为具有嗜上皮性,根据这一特性开展该病毒的致病机制研究,对于水泡性口炎疾病的防治意义重大。本研究以犊牛口腔黏膜上皮为材料,分离培养犊牛原代口腔黏膜上皮细胞,经形态学观察、细胞贴壁率和生长曲线计算、流式细胞仪检测等系统鉴定,确定已成功建立了一种原代犊牛口腔黏膜上皮细胞培养方法,并获得高纯度的原代上皮细胞,为研究具有嗜上皮性病毒的侵入机制和细胞cDNA文库构建提供了良好的实验体系。将VSV接种于犊牛口腔黏膜上皮细胞,应用超薄切片技术进行病毒的形态发生和细胞超微结构变化特征的观察,通过接毒细胞出现病变和电镜观察到弹状病毒样粒子,证实VSV可感染原代培养的犊牛口腔黏膜上皮细胞,并能繁殖扩增病毒。通过超微结构观察,初步明确VSV对该细胞的侵袭过程,且病毒通过细胞膜和胞浆内的空泡膜上出芽增殖后获得囊膜而成熟。将原代细胞大量培养增殖后,提取细胞的总RNA后分离其mRNA,利用噬菌体表面展示技术,构建了对VSV具有高反应性的CPMBCs高质量cDNA表达文库。未扩增文库的滴度为1.3×107 pfu/mL,文库重组率为95.8%,扩增后文库滴度为2.4×1010 pfu/mL。为高通量地从库中筛选出与VSV相互作用的噬菌体重组子,即寻找该病毒相互作用受体蛋白奠定了坚实的基础。用纯化的VSV与构建的T7噬菌体展示文库进行文库筛选,获得一个VSV可能的受体蛋白基因功能区片段。该基因片段长度为801bp,含有一大小为375bp的开放阅读框,编码124个氨基酸残基,将其命名为CPMBCsCP1。测序结果经登陆NCBI BLAST核酸同源性检索为与人类的剪接因子3b的同源性较高。DNAStar软件和ScanProsite分析结果表明是CPMBCsCP1蛋白亲水性较好,具有免疫原性和良好的抗原性,其生物学活性有可能在细胞信号传导通路中接受多种信号的调控。该项研究不仅为VSV由其受体介导的分子致病机制研究奠定坚实的基础,而且将为我国针对VSV引发疾病的防治研究提供参考依据。

周飞,任建林,董菁^[4]（2008）在《乙型肝炎病毒囊膜蛋白候选结合蛋白的研究进展》文中进行了进一步梳理HBV囊膜蛋白基因具有多个可变的起始编码位置,囊膜蛋白可能包含前前-S、前-S1、前-S2以及主蛋白等区域,不同长度的囊膜蛋白组分与肝细胞内蛋白的相互作用机制并不清楚.本文着重探讨了现有的蛋白-蛋白相互作用的研究手段,总结了目前宿主肝细胞可能与HBV囊膜蛋白相互作用的蛋白,但目前获得的大部分结果需进一步验证.

周飞^[5]（2008）在《乙型肝炎病毒全S蛋白候选相互作用蛋白研究》文中提出目的:分子流行病学方法检测厦门地区乙型肝炎病毒（HBV）病毒株前前S基因编码的广泛性。酵母双杂交技术自健康人肝细胞cDNA文库中筛选HBV全S蛋白相互作用蛋白基因,并以反向酵母双杂交方法验证候选结合蛋白。通过病毒蛋白-宿主蛋白作用探讨全S蛋白在肝细胞内的可能存在的分子作用机制。方法:应用多聚酶链反应（PCR）技术自慢性HBV感染患者外周血扩增全S基因序列,选择克隆进行DNA测序及生物信息学分析。选择克隆w216作为研究靶基因,定向克隆到pDEST32构建表达全S基因诱饵质粒,命名为pDEST32-w216,western blot法验证pDEST32-w216的表达。酵母双杂交系统筛选人肝细胞cDNA文库,选择阳性克隆质粒DNA测序,进行生物信息学技术分析。根据正向酵母双杂交的结果,PCR法扩增醛缩酶B、纤维蛋白原α链、类蓟苦素γ家族成员6、烯酰辅酶A水合酶基因构建成诱饵质粒,将4个不同突变株全S基因构建成猎物质粒,反向酵母双杂交法验证正向筛选候选结合蛋白。结果:成功自20个患者中测序全S区基因20条序列,18个来自C2亚基因型的病毒S基因均编码前前S基因。以w216为靶基因经酵母双杂交实验研究,自肝细胞cDNA文库中筛选后获得了25个可能与全S蛋白发生特异性相互作用的阳性克隆,其中8个阳性克隆的猎物载体内插入基因为已知蛋白基因,分别为醛缩酶B、血清白蛋白、跳跃蛋白、纤维蛋白原α链、类蓟苦素γ家族成员6、烯酰辅酶A水合酶、2个血管上皮钙粘蛋白,3个阳性克隆为未知功能基因。将筛选出的醛缩酶B、纤维蛋白原α链、类蓟苦素γ家族成员6、烯酰辅酶A水合酶等靶基因对不同的全S基因突变体进行反向酵母双杂交,结果证明这四种宿主多肽/蛋白可以与HBV全S蛋白发生相互作用,其全S蛋白的结合区域可能位于前268 aa。结论:厦门地区HBV感染者S基因的存在可能是以全S基因形式存在;筛选并验证了4种宿主多肽/蛋白可以与HBV全S蛋白相互作用,提示HBV囊膜蛋白影响肝细胞的糖代谢、脂肪代谢、细胞增殖和纤维蛋白分泌。探索了HBV囊膜蛋白可能存在的致病机制。

田江克^[6]（2007）在《乙型肝炎病毒截短型表面抗原中蛋白结合蛋白基因的筛选研究》文中进行了进一步梳理乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是严重影响我国人民健康的重要传染病，可引起急、慢性病毒性肝炎，导致肝纤维化（LC），甚至肝细胞癌（HCC）。HBV感染致肝细胞损伤机制，很大程度上与病毒蛋白和宿主细胞蛋白间的相互作用相关。因此，研究HBV抗原成分与宿主细胞蛋白相互作用及其机理能在一定程度上对HBV的致病机制做出解释，为寻找有效防治HBV的方法提供新线索。HBV基因组具有4个主要的开放读码框架（ORF），分别命名为S、C、P、X区，其中S区通过三个框架（in-frame）内起始密码子（ATG）分为三个结构域：前-S1，前-S2和S结构域，由此3个ATG开始编码产生3种大小不同的表面抗原蛋白：主蛋白（SHBs），中蛋白（MHBs．前-S2+S）和大蛋白（LHBs：前-S1+前-S2+S）。完整的MHBs多肽链是由55个aa的PreS2区和226个aa的S区组成的，研究表明，羧基末端截短形式的HBV表面抗原中蛋白（MHBst）具有反式调节功能，在HBV致病（癌）过程中发挥着重要的作用，但MHBst与宿主细胞的结合蛋白目前还不十分清楚。为研究羧基末端截短形式的HBV表面抗原中蛋白的结合蛋白，本实验应用酵母双杂交技术筛选表达型cDNA白细胞文库中与MHBst的结合蛋白的基因。酵母双杂交是一种研究蛋白-蛋白间相互作用的比较快速、可靠并可大规模筛选的技术。本实验采用酵母双杂交系统-3，利用两种单倍体酵母a和α接合型可以配合形成二倍体，而其中表达的外源蛋白仍能相互作用，免去了低效率文库质粒与诱饵质粒共转染的问题，大大提高了杂交效率；在原技术基础上增加了3个报告基因，降低了假阳性率，保证实验结果的真阳性率达95％。我们首先利用多聚酶链反应（PCR）方法扩增羧基末端167位aa截短的HBV表面抗原中蛋白的基因编码序列，经酶切鉴定正确并连接入酵母表达载体pGBKT7中构建“诱饵”质粒，转化酵母细胞AH109（a型）并在其内表达，Western-blotting验证。然后与转化了人白细胞cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187（α型）进行配合。结果成功克隆出MHBst蛋白并在酵母细胞中表达，配合后选出既能在四缺（SD／-Trp-Leu-Ade-His）培养基又能在铺有X-α-半乳糖（X-α-gal）的四缺培养基上生长并变成蓝色的菌落10个。提取阳性酵母菌落的质粒，电穿孔法转化大肠杆菌，接种在氨苄青霉素-LB平板上选择并测序，经生物信息学分析，排除读码框架不正确者，最后得到9种已知基因，ADP核糖基因子2个，RAB6相互作用蛋白1个，CCR4-NOT转录复合体亚基10（CCR4-NOT-10）1个，脂多糖蛋白结合蛋白（LBP）1个，醛缩酶B（ALDOB）1个，补体成分3（C3）1个，丙酮酸脱氢酶（PDH）1个，人类细菌人工染色体（BAC）1个。为进一步确证经酵母双杂交技术筛选出的结合蛋白与诱饵蛋白间在体外也有相互作用，我们扩增出脂多糖结合蛋白（LBP）基因并克隆入酵母表达载体pGADT7，在TNT网织红细胞裂解物体外翻译，掺入同位素35S，与相应的“诱饵”蛋白进行体外免疫共沉淀反应，进一步证实LBP可以与MHBst特异性结合。本研究成功克隆出MHBst结合蛋白，为进一步研究其在HBV感染中的作用提供了新线索。

刘霞^[7]（2007）在《乙型肝炎病毒大蛋白与HBV DNA的相关性及其致病机制的初步研究》文中指出乙型肝炎病毒大蛋白（large surface proteins of hepatitis B virus，LHBs）是唯一一种具有双重拓扑结构、致肝细胞毒性、反式激活增强病毒复制作用的乙型肝炎病毒包膜蛋白，广受国内外学者关注。由于LHBs具有细胞内强滞留性，在体外难以表达，表达过程中又极易降解，因此将LHBs作为一个整体来进行功能研究相对较少。近年来，通过蛋白修饰等技术，已经可以在体外完整表达并纯化出LHBs，从而使LHBs相关功能研究成为可能。目前临床上通常以HBeAg来判断乙肝病毒复制及传染性强弱，但当乙肝病毒发生前C与C区变异后，会出现HBeAg阴性而病毒仍保持复制状态的情况，造成临床难以根据HBeAg确定治疗时机。在抗病毒治疗过程中，血清HBV DNA拷贝数的下降是评估其疗效的主要指标，但由于核苷类抗病毒药物只能抑制HBVDNA复制，并不能抑制已经形成的病毒以其DNA为模板的转录和病毒蛋白的表达，故认为在监测病毒复制、观察治疗效果上仅仅采用HBeAg和HBV DNA指标是不够的，有必要增加具有反式激活病毒复制功能和直接对肝细胞产生毒性蛋白的蛋白因子检测，对于这个指标，LHBs是适合的。HBV能够感染肝细胞的关键是HBV和肝细胞表面受体结合。研究发现LHBspre-S区在空间上具有独特的双重拓扑结构，在包膜内侧可以和HBV核衣壳结合，外侧可与易感细胞受体结合，而究竟HBV与何种肝细胞表面受体结合以及结合后HBV是如何进入肝细胞的，有待进一步研究。另外两种包膜蛋白的功能研究发现，pre-S1蛋白参与HBsAg的运输与分泌，pre-S2则介导HBV粘附人肝细胞，此二者被作为HBV一个新的具有传染性和复制的标志物，可能参与了HBV肝细胞内的装配及分泌。基于噬菌体表面展示的高通量筛选是目前寻找靶蛋白结合肽的优选策略，已被广泛应用到配体-受体关系的研究之中。我们拟采用噬菌体展示的方法，以三种HBV包膜蛋白为靶蛋白，寻找可能与之相结合的肝细胞表面受体蛋白。然后利用RNAi技术，敲除肝细胞表面特异性受体蛋白，观察对HBV感染肝细胞的影响，以此来证实该蛋白是HBV入侵肝细胞的关键受体蛋白。为此，我们首先收集200例慢性HBV感染者的血清，检测HBV LHBs、HBeAg与HBV DNA拷贝数的关联性；同时，应用噬菌体展示技术筛选出可能与三种HBV包膜蛋白相结合的肝细胞膜蛋白，进而通过RNA干扰来验证其是否为肝细胞表面与HBV包膜蛋白确实相结合的蛋白。主要研究内容和研究结果如下：一、乙肝病毒大蛋白与HBeAg、HBV DNA的相关性研究目的：检测LHBs、HBeAg与HBV DNA拷贝数的关联性，以期寻找对病毒的复制、疗效判断更为敏感的指标。方法：收集200例慢性HBV感染者血清，应用荧光实时定量PCR法检测HBV DNA含量，ELISA法检测LHBs和HBeAg含量。采用卡方检验和方差分析对血清LHBs水平与HBV DNA对数值和HBeAg含量之间相关性进行分析。结果：200例慢性HBV感染者中，HBV DNA阳性率为52.5％（105／200），LHBs阳性率为55％（110／200）（x2=0.72，P＞0.05）：HBeAg阳性率为54.5％（109／200）；LHBs含量与HBV DNA拷贝数对数值之间有良好的相关性，相关系数（r=0.935，P＜0.01），方差分析显示不同HBV DNA拷贝数组之间，LHBs含量差异有统计学意义（F=136.0，P＜0.01）。结论：血清LHBs和HBV DNA协同检测更能代表HBV病毒复制，并有望成为乙肝治疗疗效判定和治疗时机评定指标。二、噬菌体表面展示技术筛选乙肝病毒大蛋白结合蛋白目的：筛选LHBs在正常肝细胞表面的结合蛋白。方法：以纯化的LHBs为固相筛选蛋白，用正常人肝细胞的噬菌体T7 cDNA文库进行5轮生物筛选，经噬斑PCR，挑选片段长度不一的克隆，应用酶联免疫吸附试验（ELISA）验证所筛选出结合蛋白，然后对其DNA序列进行测序，将所得DNA序列相对应的氨基酸序列在GenBank中搜索，确定可能与LHBs相结合的蛋白。结果：经ELISA验证获得35个阳性克隆，经同源搜索，初步确定22个可能与LHBs相结合的肝细胞表面蛋白，其中包括人类去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）、人类辅助蛋白5受体等22个已知蛋白，同时还发现9个未知功能蛋白。结论：发现了31个可能与LHBs结合的肝细胞表面蛋白，为进一步研究与LHBs特异性结合的蛋白提供基础。三、噬菌体表面展示技术筛选pre-S1、pre-S2蛋白结合蛋白目的：寻找乙型肝炎病毒pre-S1、pre-S2蛋白结合蛋白。方法：分别以纯化的HBV pre-S1、pre-S2蛋白为固相筛选蛋白，用正常人肝细胞的噬菌体T7 cDNA文库进行5轮生物筛选，经噬斑PCR，挑选片段长度不一的克隆，应用ELISA验证所筛选出结合蛋白，然后对其DNA序列进行测序，将所得DNA序列相对应的氨基酸序列在GenBank中搜索，确定可能与HBV pre-S1、pre-S2蛋白相结合的蛋白。结果：ELISA分别测定筛选的pre-S1与pre-S2蛋白噬斑裂解液与噬菌体抗体结合的活性，经同源性搜索，初步确定pre-S1结合蛋白25个，pre-S2结合蛋白15个。可能与HBV pre-S1相结合的蛋白包括人体载脂蛋白H，PI-3激酶相关激酶SMG-1同类蛋白等22个已知蛋白，同时还发现3个未知功能蛋白；与HBV pre-S2相结合的蛋白包括细胞色素P450 I类A型亚基克隆2个、PI-3激酶相关激酶SMG-1同类蛋白3个、细胞生长抑制蛋白42有2个、膜联蛋白A11转录变异体有1个、转录激活因子5有3个、α酸性糖蛋白有2个、未知功能蛋白2个。结论：发现了25个可能与HBV pre-S1蛋白相结合的肝细胞表面蛋白，15个可能与HBV pre-S2蛋白相结合的肝细胞蛋白，为进一步研究HBV入侵肝细胞途径提供新思路。四、去唾液酸糖蛋白受体shRNA表达载体的构建及初步功能鉴定目的：证实ASGPR为HBV入侵肝细胞的关键受体。方法：利用RNA干扰技术，设计合成靶向ASGPR的shRNA寡核苷酸序列，将其克隆至带有U6启动子的Pgenesil-1真核表达载体中，构建重组质粒，酶切鉴定、测序分析。将此重组质粒转染入HepG2细胞，敲除肝细胞膜上的ASGPR，观察缺失ASGPR对HBV感染肝细胞的影响。结果：已经成功构建靶向ASGPR的shRNA真核表达载体。结论：为明确ASGPR是否为肝细胞表面与LHBs相结合的关键蛋白奠定基础。

成军^[8]（2006）在《慢性肝炎病毒感染致病机制相关新基因克隆化研究策略》文中提出乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）的慢性感染,与慢性病毒性肝炎、肝硬化、肝细胞癌（HCC）的发病密切相关,其发病机理涉及到很多基因的共同参与.病毒基因的复制和表达受到肝细胞中蛋白质因子的调节,肝炎病毒基因编码的蛋白与肝细胞中的蛋白能够结合,肝炎病毒蛋白在肝细胞中的表达对于肝细胞的基因表达谱产生影响,也可能是病毒性肝炎、肝硬化、肝细胞癌发病机制的重要机制.酵母单杂交技术、酵母双杂交技术、基因芯片技术、抑制性消减杂交技术、噬菌体展示技术、蛋白质分离纯化与基因克隆化的反向遗传学技术等,在肝炎病毒基因调控、肝炎病毒蛋白结合蛋白的研究、肝炎病毒蛋白反式激活靶基因的研究中都有重要的应用,是促进慢性病毒性肝炎发病机理研究,探索病毒性肝炎新型治疗技术和治疗方法的有效途径.

何茂锐^[9]（2006）在《运用T7噬菌体展示技术筛选乙型肝炎病毒PreS1相互作用蛋白的实验研究》文中研究说明第一部分乙型肝炎病毒PreS1融合蛋白的表达、纯化及性质鉴定目的:构建含乙型肝炎病毒（HBV）PreS1基因的原核表达载体并在大肠杆菌中高效表达,获得纯化的PreS1融合蛋白,并对其性质进行鉴定,为进一步从人肝细胞cDNA表达文库中筛选PreS1相互作用蛋白奠定基础。方法:采用PCR法扩增含HindⅢ与XbaⅠ酶切位点的PreS1基因片段,原核表达载体pGST-MOLUC及PCR产物经双酶切后,用T4DNA连接酶将两者连接并转化到大肠杆菌JM109构建并筛选重组质粒。随后将重组质粒转入表达宿主菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导表达,对表达蛋白进行SDS-PAGE电泳分析和Western-blot检测。以谷胱甘肽-Sepharose 4B凝胶为填料进一步采用亲和层析纯化融合蛋白。结果:用PCR方法扩增出与预期大小一致的目的基因片段。重组质粒经双酶切鉴定及测序分析证实重组质粒克隆成功,命名为pGST–PreS1。转化表达宿主菌后成功诱导出分子量为37kD的GST -PreS1融合蛋白,与预期分子量相符,诱导表达融合蛋白约占总菌蛋白的10%左右。Western-blot检测表明诱导表达的融合蛋白能分别与抗GST的

成军,董菁,王建军,张健,纪冬,钟彦伟,刘妍,王琳^[10]（2005）在《乙型肝炎病毒前-S1蛋白结合蛋白小鼠同源基因的生物信息学分析》文中指出目的克隆、鉴定乙型肝炎病毒（HBV）前-S1蛋白结合蛋白（PS1BP）小鼠同源基因,并进行初步的生物信息学分析。方法以克隆的人PS1BP基因序列作为参照,利用美国国立卫生研究院国立医学图书馆生物工程信息学中心建立的的核苷酸数据库,以及在线核苷酸序列同源性比对分析软件BLASTn,与数据库中已经收录的小鼠cDNA序列进行比对,确定PS1BP小鼠同源基因,比较人和小鼠PS1BP的蛋白质一级结构序列的同源性。对小鼠PS1BP蛋白质一级结构的特点进行生物信息学分析,并确定小鼠PS1BP基因组DNA的结构特点。结果通过不同种属核昔酸序列的同源性比对,确定小鼠PS1BP的cDNA由1455nt组成,编码产物由484aa组成。与人PS1BP蛋白质一级结构的同源性为84.92％（411／484）。对小鼠PS1BP蛋白一级结构序列进行生物信息学分析,发现一系列潜在的蛋白修饰位点。以小鼠PS1BP的cDNA序列作为参照,对高通量基因序列数据库进行同源基因的搜索,发现小鼠的一段基因组DNA序列（AC117576.3）与之同源,进一步的分子结果表明,小鼠的PS1BP基因组DNA含有3段外显子序列,2段内含子序列。结论确定了小鼠PS1BP基因序列,为进一步研究其功能和生物学作用奠定了基础。

二、噬菌体表面展示技术筛选乙型肝炎病毒前S1蛋白结合蛋白基因（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、噬菌体表面展示技术筛选乙型肝炎病毒前S1蛋白结合蛋白基因（论文提纲范文）

（1）噬菌体展示技术在HBV前-S1蛋白反式激活基因1启动子DNA的结合蛋白筛选中的应用（论文提纲范文）

（2）传染性法氏囊病毒感染鸡胚成纤维细胞机理研究（论文提纲范文）

（3）犊牛口腔黏膜上皮细胞cDNA文库的构建及其水泡性口炎病毒受体的筛选（论文提纲范文）

（4）乙型肝炎病毒囊膜蛋白候选结合蛋白的研究进展（论文提纲范文）

（5）乙型肝炎病毒全S蛋白候选相互作用蛋白研究（论文提纲范文）

（6）乙型肝炎病毒截短型表面抗原中蛋白结合蛋白基因的筛选研究（论文提纲范文）

（7）乙型肝炎病毒大蛋白与HBV DNA的相关性及其致病机制的初步研究（论文提纲范文）

（8）慢性肝炎病毒感染致病机制相关新基因克隆化研究策略（论文提纲范文）

（9）运用T7噬菌体展示技术筛选乙型肝炎病毒PreS1相互作用蛋白的实验研究（论文提纲范文）

（10）乙型肝炎病毒前-S1蛋白结合蛋白小鼠同源基因的生物信息学分析（论文提纲范文）

四、噬菌体表面展示技术筛选乙型肝炎病毒前S1蛋白结合蛋白基因（论文参考文献）

• [1]噬菌体展示技术在HBV前-S1蛋白反式激活基因1启动子DNA的结合蛋白筛选中的应用[J]. 纪冬,成军,韩萍,邵清,陈国凤. 中华实验和临床感染病杂志(电子版), 2012(04)
• [2]传染性法氏囊病毒感染鸡胚成纤维细胞机理研究[D]. 赵绪永. 河南农业大学, 2009(05)
• [3]犊牛口腔黏膜上皮细胞cDNA文库的构建及其水泡性口炎病毒受体的筛选[D]. 宋德光. 吉林大学, 2008(07)
• [4]乙型肝炎病毒囊膜蛋白候选结合蛋白的研究进展[J]. 周飞,任建林,董菁. 世界华人消化杂志, 2008(16)
• [5]乙型肝炎病毒全S蛋白候选相互作用蛋白研究[D]. 周飞. 福建医科大学, 2008(12)
• [6]乙型肝炎病毒截短型表面抗原中蛋白结合蛋白基因的筛选研究[D]. 田江克. 中国人民解放军军事医学科学院, 2007(04)
• [7]乙型肝炎病毒大蛋白与HBV DNA的相关性及其致病机制的初步研究[D]. 刘霞. 山东大学, 2007(03)
• [8]慢性肝炎病毒感染致病机制相关新基因克隆化研究策略[J]. 成军. 大连大学学报, 2006(04)
• [9]运用T7噬菌体展示技术筛选乙型肝炎病毒PreS1相互作用蛋白的实验研究[D]. 何茂锐. 重庆医科大学, 2006(01)
• [10]乙型肝炎病毒前-S1蛋白结合蛋白小鼠同源基因的生物信息学分析[J]. 成军,董菁,王建军,张健,纪冬,钟彦伟,刘妍,王琳. 中华肝脏病杂志, 2005(04)

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