MAGE-3抗原肽在体外诱导肝细胞癌患者的免疫反应

MAGE-3抗原肽在体外诱导肝细胞癌患者的免疫反应

一、MAGE-3抗原肽体外诱导肝癌患者免疫应答的研究(论文文献综述)

韩淑兰[1](2020)在《载黄芩苷多功能纳米粒构建及抗肿瘤研究》文中研究表明黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)为唇形科(Labiatae)、黄芩属(Scutellaria)、一年或多年生药用植物,具有调节免疫和抗肿瘤等多种药理活性。近年来,黄芩在调节免疫、抗病毒、抗肿瘤等方面得到广泛应用。黄芩苷(Baicalin,C2iH18o11)是一种存在于黄芩植物根茎叶中的主要黄酮类化合物。研究表明黄芩苷具有调节机体免疫的功能,通过激活自身免疫系统的免疫识别和杀伤,攻击和清除肿瘤细胞。因此,黄芩苷在肿瘤化疗与免疫治疗方面具有广阔的应用前景。然而黄芩苷为难溶性药物,溶出速率慢,导致机体吸收差、生物利用率低,限制了其临床应用。为了增加药用植物资源临床应用,改变药物应用方式是一种理想的解决办法目前,纳米药物递送系统是实现药物高效利用的有效方法,通过仿生修饰和靶向设计等可延长药物体内循环时间,并提高药物在肿瘤部位的蓄积,降低药物的毒副作用,减少药物用量,提高药物利用率。因此,本研究拟构建一种共载黄芩苷联合免疫增强剂的多功能聚合物纳米粒,充分发挥黄芩苷肿瘤杀伤化疗及免疫治疗双重功效,提高黄芩苷在抗肿瘤治疗中的应用效率;在此基础上,进一步构建靶向肿瘤部位的载黄芩苷纳米粒,改善肿瘤免疫微环境,并借助黄芩苷的细胞毒性作用,在体内外形成免疫治疗和化疗的联合抗肿瘤效应,为提高药用植物活性成分利用率提供了新的思路。具体研究分述如下:1、通过优化参数条件构建了一种载黄芩苷的小粒径PLGA纳米粒(PLGA-B)。制备的载黄芩苷PLGA纳米粒呈球形、表面光滑、粒径在120 nm左右,具有较窄的粒径分布和良好的多分散性(PDI:0.103)。体外细胞实验表明,黄芩苷和载黄芩苷PLGA纳米粒可激活树突状细胞(DCs),增加DCs表面标志分子和共刺激分子的表达。此外,黄芩苷和载黄芩苷PLGA纳米粒可阻滞肿瘤细胞周期在G2/M期,导致肿瘤细胞凋亡。这些结果表明载黄芩苷PLGA纳米粒具有激活免疫细胞和诱导肿瘤细胞凋亡的双重功效。2、为了增强PLGA-B纳米粒的免疫激活能力,在PLGA-B纳米粒的基础上,构建了共包埋黄芩苷和肿瘤抗原(Hgp 10025-33,Hgp)、且表面偶联免疫增强剂(CpG)的PLGA纳米颗粒,在纳米粒表面进一步包裹半乳糖插入的红细胞膜,赋予纳米粒仿生长循环和靶向肿瘤部位的能力。细胞实验结果表明,小粒径仿生纳米粒增加了体外细胞对药物的摄取,促进了肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)表型逆转。动物实验研究发现,与载黄芩苷的PLGA-NPs(B@NPs)相比,半乳糖插入的红细胞膜修饰的仿生纳米粒NPs@RBC-Gala有效靶向肿瘤部位,并被高表达半乳糖凝集素的M2-TAMs摄取,显着逆转了体内肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)的表型,由促肿瘤M2型向抗肿瘤M1型转变;研究也发现,在仿生纳米粒诱导下,抗肿瘤免疫细胞CD4+T和CD8+T淋巴细胞向肿瘤部位的浸润明显增加,显示免疫激活效应和T细胞反应显着增强,有效抑制了黑色素瘤在体内的生长,抑瘤率达到了65.7%。这些结果表明靶向肿瘤部位的仿生PLGA纳米颗粒可以靶向肿瘤部位,激活抗肿瘤免疫反应,实现抗肿瘤效应的提升。3、为了进一步研究共加载黄芩苷、CpG和黑色素瘤抗原肽片段Hgp25-33的复合纳米粒对肿瘤微环境的影响,进一步在其表面成功偶联修饰了 M2-TAMs的靶向肽(M2pep和α-pep肽),构建了双重靶向M2-TAMs的载黄芩苷复合纳米粒,标记为B/H@NPs@CpG-αmp。靶向M2-TAMs 载黄芩苷复合纳米粒(B/H@NPs@CpG-αmp)具有很好的粒径分布和PBS储存稳定性,其粒径为123.6 nm,小粒径有利于细胞摄取;在酸性环境下黄芩苷、Hgp和CpG可从复合纳米粒中持续释放7天,释放率均大于80%;细胞实验表明,M2pep和α-pep肽增强了复合纳米粒对肿瘤微环境中M2-TAMs的靶向能力,体外有效诱导M2型巨噬细胞表型逆转;靶向M2-TAMs载黄芩苷复合纳米粒与巨噬细胞联合应用显示了比较好的的体外抗肿瘤效果,肿瘤细胞凋亡比例最高为69.72%,这为体内动物抗肿瘤实验奠定了基础。4、为了检测双重靶向M2-TAMs的载黄芩苷复合纳米粒(B/H@NPs@CpG-αmp)是否有效靶向肿瘤微环境中M2-TAMs,刺激M2-TAMs表型逆转,改善肿瘤微环境,进一步研究了双重靶向M2-TAMs的载黄芩苷复合纳米粒(B/H@NPs@CpG-αmp)的体内抗肿瘤机制。动物实验结果表明,双重靶向M2-TAMs载黄芩苷复合纳米粒体内有效靶向M2-TAMs,在酸性溶酶体环境中可引起纳米粒表面聚多巴胺的裂解,复合纳米粒中黄芩苷等细胞毒素和免疫调节剂缓慢释放。黄芩苷和CpG的释放逆转了 TAMs表型,由促肿瘤M2型到抗肿瘤M1型,诱导M1型TAMs共刺激分子CD86的表达,表达量提升至38.42%,M2型TAMs共刺激分子CD206的表达量大大降低(仅为6.03%),促进了 TAMs释放应激细胞因子IL-12、IL-2和IFN-γ,活化的TAMs也将抗原呈递给T细胞,进一步刺激了 T淋巴细胞的抗肿瘤反应;此外,黄芩苷释放对局部黑素瘤细胞也具有杀伤作用,同时还改善了肿瘤微环境,促进T细胞、NK细胞在肿瘤部位的浸润。肿瘤冷冻切片中显示Th1细胞、CTL和NK细胞在肿瘤部位的浸润分别达到了 21.2%、24.93%和25.38%,黄芩苷还可有效抑制肿瘤血管生成,抑制肿瘤细胞转移;靶向M2-TAMs修饰的载黄芩苷复合纳米粒B/H@NPs@CpG-αmp表现出很强的抗肿瘤作用,体内肿瘤抑制率达到73.5%。这些结果表明靶向M2-TAMs修饰的载黄芩苷复合纳米粒改变了肿瘤微环境,由促肿瘤发生发展微环境重塑为抗肿瘤微环境,肿瘤微环境的改变是抗肿瘤治疗过程中至关重要的阶段。综上所述,本论文成功构建了共携载肿瘤抗原和免疫刺激剂的载黄芩苷PLGA纳米粒,纳米粒有效靶向肿瘤部位,并有效逆转TAMs表型,通过招募免疫细胞杀伤肿瘤细胞,同时传递化学活性药物,实现双重协同作用,重塑抗肿瘤微环境,达到高效抗肿瘤的目的。体内肿瘤治疗结果表明,构建的新型载低剂量黄芩苷复合纳米粒递送系统发挥了良好的增强抗肿瘤化疗与免疫治疗效应,提高了黄芩苷的抗肿瘤应用效率,提升了黄芩药用植物的资源利用价值,也为开发安全有效的抗肿瘤递送系统提供了新思路。

吴婉文[2](2020)在《基于TCGA数据库筛选点突变肿瘤新抗原诱导特异性CTL的研究》文中进行了进一步梳理目的基于TCGA数据库的基因突变测序数据来预测肿瘤新生抗原,结合生物信息学设计抗原表位肽,通过免疫原性实验筛选出理想的抗原表位肽,诱导能高效激活细胞免疫反应的特异性CTL克隆,并对其TCR基因表达情况进行分析,分析将特定肿瘤新抗原作为抗肿瘤治疗靶点的可能性。方法一、在TCGA数据库中筛选出结直肠癌,肺癌,肝癌基因前10位碱基单取代的高频突变位点,运用生物信息学计算机预测算法选择与MHC亲和力高的3组抗原表位肽并合成。基于TCGA数据库,查找表达KRAS G12V,TP53 R158L,CTNNB1 K335I突变型及野生型癌症患者的生存资料,并对其生存曲线进行分析。探讨KRAS G12V,TP53 R158L,CTNNB1 K335I突变热点分布在各癌症中的发生率及覆盖率。二、通过流式初步检测3组抗原表位肽与MHC分子的亲和力,用各组突变肽与野生肽体外诱导出特异性细胞毒性T淋巴细胞。通过IFN-r的分泌和钙黄绿素的检测方法,初步验证肽诱导特异性CTL对负载肽-T2细胞模型的杀伤功能。三、构建表达3个点突变基因的重组真核表达质粒并分别转染入HCT116结肠癌细胞,NCI-H292肺癌细胞,Hep G2肝癌细胞系,通过流式细胞仪检测转染效率和q PCR检测点突变基因在肿瘤细胞系中的表达情况。用钙黄绿素法和CFSE-PI染色法验证肽诱导特异性CTL对野生型与突变型的肿瘤细胞的细胞毒作用。流式检测肽特异性CTL杀伤野生型与突变型肿瘤细胞颗粒霉素B的表达,以及ELISA检测IFN-γ和穿孔素的分泌情况。四、提取诱导前的原PBMC细胞,CTNNB1突变肽(IMRTYTYEI)诱导的特异性T细胞的RNA样本并反转录,采用多重PCR扩增及毛细管电泳检测CTNNB1突变肽(IMRTYTYEI)诱导的特异性T细胞TCR Vα和Vβ链CDR3区基因的表达情况。结果一、结合TCGA数据库找到KRAS G12V,TP53 R158L,CTNNB1 K335I的3组高频基因突变位点,通过肽预测算法筛选出3组野生肽与突变肽,包括KRAS G12V组野生肽与突变肽,TP53 R158L组野生肽与突变肽,CTNNB1 K335I组野生肽与突变肽。通过生存分析发现KRAS G12V点突变的结肠癌患者总体生存率(OS)高于KRAS非G12V突变的其他结肠癌患者;且预测的3组肿瘤新抗原在肿瘤患者中有一定的覆盖率,有较好的临床应用价值。二、经流式初步检测,CTNNB1组突变肽与HLA-A2分子的亲和力较好(P<0.001);经DC负载肽诱导培养的抗原特异性CTL细胞,是以CD8+T细胞毒性Tc细胞为主的T细胞。Elisa初步检测表明,CTNNB1组肽诱导的特异性CTL对负载肽-T2细胞的IFN-r分泌量最多(P<0.05),其次是TP53组和KRAS组;CTNNB1组突变肽特异性CTL对负载肽-T2细胞模型的杀伤率均高于其余2组。三、3组点突变基因在肿瘤细胞系中的转染效率较高且呈过表达状态。经钙黄绿素和CFSE-PI法的检测,发现3组突变肽诱导特异性CTL对肿瘤细胞杀伤率均高于野生肽诱导的CTL(P<0.001)。但与TP53组和KRAS组相比,CTNNB1组突变肽诱导特异性CTL对突变型和野生型肿瘤细胞的细胞毒作用更强(P<0.01)。通过流式检测颗粒酶素B,ELISA检测穿孔素和IFN-γ的分泌情况,发现CTNNB1突变肽组颗粒酶素B,穿孔素和IFN-γ的分泌浓度均远高于TP53组和KRAS组(P<0.01)。四、经毛细管电泳分析,发现CTNNB1突变肽(IMRTYTYEI)诱导后的CTL细胞部分TCR Vα链CDR3区的Vα14,Vα7,Vα9亚家族和TCR Vβ链出现Vβ1,Vβ15,Vβ18亚家族发生了克隆性增殖。结论本研究发现,3组筛选出来的点突变抗原表位肽均能提高特异性T细胞的细胞毒作用,其中CTNNB1突变肽(IMRTYTYEI)诱导作用最强,能高效激活T细胞免疫反应,介导针对肿瘤细胞的特异性细胞毒作用。本研究提示,CTNNB1 K335I点突变表位肽可能具有应用于个体化细胞免疫疗法的潜力。

李申奥[3](2019)在《胶质瘤相关抗原MAGE-D4 T细胞抗原肽的预测和鉴定》文中认为目的:预测胶质瘤相关抗原MAGE-D4的HLA-A2限制性T细胞抗原肽,分析这些抗原肽负载DC后是否能诱导出具有肿瘤杀伤作用的T细胞,为MAGE-D4的胶质瘤免疫治疗提供实验依据。方法:(1)MAGE-D4表位肽的预测:利用SYFPEITHI和BIMAS网站,分析HLA-A*0201限制性MAGE-D4 T细胞抗原肽,筛选高得分的候选肽;(2)肽-HLA-A2亲和力检测:合成筛选出的抗原肽,将抗原肽与T2细胞孵育,流式细胞仪检测HLA-A2表达荧光强度,分析抗原肽肽与HLA-A2的亲和力;(3)HLA-A*0201表型的筛选鉴定:提取胶质瘤细胞U87的DNA,用HLA-A*0201特性引物进行PCR鉴定;分离健康志愿者外周血单个核细胞(PBMC),用流式细胞仪筛选HLA-A2健康志愿者。(4)树突状细胞(DC)的体外诱导培养及鉴定:分离HLA-A*0201健康志愿者的外周血PBMC,使用磁珠分选法从PBMC中分离出CD14+细胞,将用细胞因子(rhGM-CSF、rhIL-4和TNF-a)与CD14+细胞孵育,诱导出成熟的DC,并通过形态学观察、细胞表面标志物(CD83,CD80,CD1a和HLA-DR)的流式细胞术检测对DC进行鉴定。(5)MAGE-D4抗原肽负载DC的制备:将细胞因子诱导培养至第3和第5天的DC用MAGE-D4抗原肽刺激,继续培养至第8天,收集MAGE-D4抗原肽负载DC;(6)效应T细胞的制备:T细胞磁珠分选试剂盒分离HLA-A*0201健康志愿者PBMC中的T细胞,将T细胞与MAGE-D4表位肽负载的DC(T细胞:DC为10:1)孵育,培养至第4天,再以同样的比例与MAGE-D4抗原肽负载的DC孵育,并加入IL-2继续培养4天,然后分别CCK-8和ELISPOT检测T细胞的增殖和分泌INF-γT细胞的频数。(7)效应T细胞杀伤实验:以10:1、20:1的效应细胞:靶细胞孵育,乳酸脱氢酶(LDH)释放法测定效应T细胞对U87细胞的杀伤作用。结果:(1)通过网站预测出HLA-A*0201限制性候选肽,序列如下:P1(SLLLVILGV),P2(LLQERANK),P3(CLPPPNVIL),P4(ILSNEPWEL)和P5(RLSLLLVIL);(2)流式细胞仪检测结果显示,除P1外,其余4个肽均与HLA-A*0201分子具有较好的亲和力(FI大于1)。(3)通过PCR检测确定U87细胞为HLA-A*0201表型,通过流式细胞仪筛选出HLA-A2健康志愿者。(4)CD14+细胞经细胞因子诱导后,呈现出典型的DC形态,并高表达CD1a,CD83,CD80和HLA-DR分子。(5)MAGE-D4抗原肽负载DC孵育T细胞后,CCK-8检测结果显示T细胞增殖,但各组间无统计学差异。IFN-γELISPOT检测结果显示分泌IFN-γ的T细胞显着增加,与对照组比较具有统计学差异(P<0.05)。(6)LDH检测结果显示,当效靶比为20:1时,负载P2-DC+TC组、P3-DC+TC组、P4-DC+TC组和P5-DC+TC组的效应性T细胞对U87细胞杀伤效率均明显高于未负载多肽的DC+TC组(P<0.05);其中P3-DC+TC组、4-DC+TC组和P5-DC+TC组的杀伤效果随效靶比的增大而增强(P<0.05)。结论:MAGE-D4抗原肽(LLQERANK,CLPPPNVIL,ILSNEPWEL,RLSLLLVIL)致敏的DC可在体外诱导出具有杀伤肿瘤细胞的T细胞,提示这些MAGE-D4抗原肽具有用于胶质瘤免疫治疗的潜力。

李秀真,薛庆节,路海,聂尚丹,王晖,李运清,赵龙玉,谭文彬[4](2018)在《CpG ODN协同MAGE-3抗原肽致敏DC疫苗对膀胱癌细胞BIU-87的抑制作用》文中研究表明目的:探讨含未甲基化胞嘧啶鸟嘌呤(CpG)序列的细菌寡核苷酸(CpG oligodeoxynucleotide,CpG ODN)免疫佐剂在增强黑色素瘤抗原基因-3(melanoma antigen gene-3,MAGE-3)抗原肽致敏DC抗膀胱肿瘤细胞的作用及其分子机制。方法:采用Ficoll法从健康志愿者HLA-A2型外周血中分离单个核细胞,常规方法诱导培养制备成熟DC。MTT法检测不同方式(MAGE-3、CpG ODN、MAGE-3+CpG ODN和无关抗原对照)致敏DC对T淋巴细胞增殖和CTL对靶细胞BIU-87的杀伤作用。CpG ODN+MAGE-3抗原肽致敏DC抗裸鼠BIU-87膀胱癌细胞移植瘤治疗7、11 d测定移植瘤质量变化,MTT和Western blotting法分别检测移植瘤细胞的增殖水平及其凋亡蛋白表达的变化。结果:CpG ODN+MAGE-3抗原肽致敏DC能够促进T淋巴细胞增殖(P<0.05),并显着提高活化T淋巴细胞的CTL对靶细胞BIU-87的杀伤活性(P<0.05)。体内实验表明,致敏DC治疗7、11 d的各组移植瘤质量均明显降低(均P<0.05),移植瘤的增殖能力下降也较明显(P<0.05);与其他致敏DC方式相比较,尤以CpG ODN+MAGE-3致敏DC组在治疗11 d时的移植瘤质量降低非常显着(P<0.01),且明显促进荷瘤小鼠脾脏单个核细胞的增殖能力(P<0.01);该组在治疗第3天起移植瘤组织Bcl-2表达水平明显降低、Bax水平明显升高(均P<0.05或P<0.01)。结论:CpG ODN能促进MAGE-3抗原肽致敏DC对膀胱癌BIU-87细胞的抑制作用,为膀胱癌DC疫苗的临床应用提供了实验依据。

陈仿军[5](2017)在《个体化新抗原鉴定及其在晚期恶性实体肿瘤免疫治疗中的应用》文中研究说明背景与目的:近年来免疫治疗在肿瘤治疗研究领域中获得了巨大的进步,已经成为肿瘤治疗最受瞩目的领域之一。目前越来越多的研究表明新抗原特异性T细胞是包括免疫检查点抑制剂(Immune checkpoint inhibitors)、肿瘤浸润淋巴细胞(Tumor infiltrating lymphocytes,TILs)和 T 细胞受体(T cell receptor,TCR)工程化的免疫细胞等多个免疫治疗策略获得临床响应的基石。伴随着基因组学和生物信息学的发展,使得精准的分析每个患者肿瘤特异性突变所产生的新抗原成为了可能。然而,快速高效的筛选鉴定个体化新抗原仍然充满了困难和挑战;同时,在晚期恶性实体肿瘤中缺乏新抗原鉴定及以新抗原为基础的个体化免疫治疗的系统性评价。本研究中,我们建立了两种高效快速的策略在晚期恶性实体瘤患者中行个体化新抗原鉴定:包括以靶向捕获测序和生物信息学为基础的重头开始合成抗原肽的经典模式;和构建以常见实体瘤中驱动热点突变来源的新抗原肽库为基础的新模式。同时,我们在临床试验中针对以新抗原为基础的个体化免疫治疗进行了疗效和安全性评价。研究方法:本研究中共纳入了 26例晚期恶性实体瘤患者,使用靶向肿瘤相关基因的Panel对患者的肿瘤组织、ctDNA样本,和正常组织行新一代测序(Next Generation Sequencing,NGS)以获取肿瘤中特异性的体细胞突变信息(somatic mutations)。随后,个体化新抗原的鉴定通过以下不同的策略进行:(1)、经典模式:结合患者高丰度的非同义突变信息和HLA精确分型结果,进行新抗原表位预测,选取高亲和力T细胞表位重头合成抗原肽。(2)、新抗原肽库模式:我们通过系统性的挖掘TCGA和COSMIC数据库,选择常见实体瘤中高频驱动突变基因来源的热点突变(Hotspot mutation),针对中国人常见HLA分型(HLA-A*0201、HLA-A*0203、HLA-A*0206、HLA-A*1101、HLA-A*2402),使用 3 种不同的 T细胞表位预测工具,优选表位肽并预先构建新抗原肽库。基因Panel测序获取的患者热点突变与新抗原肽库中相应的HLA限制性肽相匹配。以上两种途径所候选的抗原肽在体外通过ELISPOT、流式细胞术等技术手段检测其刺激活化T细胞后的IFN-Y和CD137的表达,来鉴定具免疫原性的新抗原;并行抗原特异性杀伤、HLA-肽亲和力等相关免疫指标评估。在临床应用中,通过COBE SpectraTM血液分离系统采集外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),进一步制备树突状细胞(Dentritic cells,DCs)和新抗原反应性 T 细胞(neoantigen reactive T cells,NRTs)。在联合免疫调节性的放化疗后,患者接受负载个体化新抗原的DC疫苗皮下注射和NRT细胞静脉回输,并行疗效和安全性评估。结果:上述测序患者中,有4例患者通过经典模式进行新抗原筛选,其中有3例患者成功鉴定出1~2个新抗原;此外,另有12例患者通过新抗原肽库模式进行抗原筛选,其中6例成功筛选出免疫原性新抗原。针对使用靶向416基因Panel进行测序的17例晚期实体瘤患者进行突变负荷和新抗原负荷评估的结果显示:检出的体细胞非同义突变(错义突变-missense mutation)数目为9~73个,中位突变数目为35个;预测到的HLA Ⅰ类分子限制性新抗原数目范围在8~140个,中位新抗原数目为55个。在临床中,共计6位患者接受了新抗原为基础的个体化免疫治疗,平均每位患者接受约108的DC疫苗和1010以上的混合T淋巴细胞(含有约109的CD8+CD137+的NRTs)。迄今,一例多线治疗失败的转移性胸腺瘤患者免疫治疗后实现了持续已超过10个月的完全缓解(CR);另一例转移胰腺癌患者实现了免疫相关的部分缓解(irPR);其余4例患者长期病情稳定,中位无进展生存时间(mPFS)延长至8.6个月。免疫治疗过程中出现发热和疫苗注射局部皮肤红肿,经对症处理后恢复正常或消退,余未见其他严重不良反应发生。结论:我们构建的驱动热点突变来源的新抗原肽库提供了一个新的快速鉴定个体化新抗原的途径;此外,靶向捕获测序亦有足够的潜力来挖掘肿瘤变异信息和用于个体化新抗原鉴定。联合使用以上不同的新抗原筛选策略可以加速新抗原为基础的转化免疫治疗研究,为精准医疗探索出一个新的突破口。

吴叶婷[6](2017)在《多靶点抗原肽自体免疫细胞治疗原发性肝细胞癌的免疫应答研究及联合TACE的临床疗效》文中研究指明研究背景及目的:肿瘤的细胞治疗属于肿瘤生物治疗范畴,旨在通过应用免疫学原理和方法,调节机体的免疫状态从而达到治疗肿瘤的目的。按照不同机制可分为主动性和过继性免疫治疗两大类,被认为是继手术、放化疗之后的又一肿瘤综合治疗方法。原发性肝癌(Primary liver cancer,PLC)是指发生于肝细胞或肝内胆管细胞的恶性肿瘤,主要包括原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)、肝内胆管细胞癌(Intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC)和肝细胞癌-肝内胆管细胞癌混合型等不同病理类型,其中HCC约占原发性肝癌的90%。HCC是我国发生率最高的恶性肿瘤之一,恶性程度较高,发病一般非常隐匿,确诊时大多数患者已达BCLC中晚期,从而失去了根治性治疗的机会,预后较差。因此HCC的免疫治疗已成为医学界的研究热点。本研究采用多靶点抗原肽自体免疫细胞治疗技术(multiple antigen stimulating cellular therapy,MASCT)诱导成熟树突状细胞(dendritic cell,DC)和细胞毒性 T 细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL),将成熟DC和CTL回输到患者体内,旨在探索MASCT治疗HCC诱导患者体内免疫应答研究及联合TACE的临床疗效。研究方法:1.MASCT诱导原发性肝细胞癌患者体内免疫应答研究分离HCC患者PBMC,贴壁细胞培养分化为非成熟DC,并负载14种抗原肽,加入促成熟因子培养分化为抗原提呈的成熟DC,成熟DC与非贴壁细胞共培养,分化形成抗原特异性CTL。用免疫荧光的方法分析抗原肽是否能被DC内化以及进入胞内的分布情况,并对回输的DC及CTL进行细胞表型及细胞因子检测。用HLA-A2+患者 CTL 和 HCC 细胞系 HepG2 细胞(HLA-A2+)、HuH-7 细胞(HLA-A2-)分别作为效靶细胞进行体外细胞杀伤实验,分析CTL杀伤肿瘤细胞的HLA限制性。前瞻性纳入13例HCC根治术后患者,每个患者预计接受3个疗程MASCT治疗,治疗期间按时随访,患者被诊断肿瘤进展,立即终止研究,转为传统治疗。患者随访期间,采集患者PBMC,分析治疗前后体内免疫应答情况,分别进行(1).T细胞亚群检测;(2).抗原特异性T细胞增殖(Edu染色)及IFN-y水平测定;(3).各抗原单肽特异性免疫应答检测。2.MASCT联合TACE治疗原发性肝细胞癌的临床疗效研究回顾性分析2010-15年南方医院肝病中心收治的66例接受TACE治疗的HCC患者,按是否联合MASCT治疗分为联合治疗组(32例)和单纯TACE组(34例),单纯TACE组采用TACE治疗,联合治疗组在TACE间歇期进行MASCT治疗。主要观察指标为两组患者的无进展生存期(PFS)和总生存期(OS)。探索联合MASCT治疗能否提高TACE的疗效,延长PFS和OS。研究结果:1.MASCT成功诱导培养mDC和CTL,多次治疗后可改善HCC患者体内免疫抑制状况,诱导特异性免疫应答经过上述MASCT细胞培养过程,患者每次接受皮下注射的DC平均2.23 ×107,这些细胞高表达DC成熟信号分子,表现出完整的免疫功能性质。此外,这些DC分泌高水平促炎因子IL12,低水平免疫抑制因子IL10。免疫荧光试验显示,抗原长肽能有效地被imDC内化,主要定位于细胞质而非溶酶体。患者每次接受回输的CTL平均6.63 × 109,这些细胞几乎全是CD3+T细胞,大部分为CD8+T细胞,小部分为CD4+和CD3+CD56+(NKT)细胞,极少量的调节性T细胞(Treg)。此外CTL上清中检测到一定量的IFN-y和TNF-α,极少量免疫抑制因子IL10和IL4。产生于HLA-A2+患者的CTL对HepG2细胞(HLA-A2+)表现出更强的细胞杀伤活性相对于HuH-7细胞(HLA-A2-)。MASCT治疗后患者不良反应少,多次MASCT治疗后,患者外周血NKT细胞,CD56+NKG2D+细胞,和效应T细胞比例上调,Treg细胞比例持续下调。此外,T细胞特异性增殖及分泌IFN-γ的能力均显着提高,T细胞对HCC抗原肽库及多种抗原单肽产生了特异性免疫应答,且未复发患者PBMC的特异性免疫应答水平显着高于复发患者。2.MASCT治疗可以显着提高TACE的疗效,延长PFS和OS。联合治疗组和单纯TACE组中位PFS分别为9.5个月和5.5个月,差异有统计学意义(p=0.001);联合治疗组和单纯TACE组中位OS分别为19.5个月和10.5个月,两组对比有统计学差异(p=0.033)。是否接受MASCT治疗、治疗前AFP水平、门静脉侵犯、ECOG评分是影响HCC患者PFS的独立预后因素;而是否接受MASCT治疗、治疗前总胆红素水平、门静脉侵犯是影响OS的独立预后因素。研究结论:1.本研究表明MASCT技术可成功诱导培养mDC及CTL,并可改善HCC患者体内免疫抑制状态,诱导针对肿瘤抗原肽的特异性免疫应答,且.会随着治疗次数的增加而增强应答。2.MASCT治疗可以显着提高TACE的疗效,延长PFS和OS。

李洁羽[7](2016)在《rhAAV/AFP感染DC分泌的Exosome诱导抗肝癌特异性T细胞的免疫效应研究》文中提出【目的】树突状细胞(Dendritic cell,DC)会分泌一种膜性微囊结构——外泌体(Exosome),它携带DC细胞的主要功能蛋白及抗原物质,可调节免疫及诱导相应的免疫应答。通过重组腺相关病毒rh AAV携带AFP基因(rh AAV/AFP)导入DC,并收获DC分泌的exosome(DEX),研究DEX体外抗肝癌免疫效应及调节机制,为进一步研究新型非细胞型DC疫苗提供实验依据,为肝癌的免疫治疗提供一个新思路。【方法】1.分离健康献血者外周血单个核细胞(PBMCs),经IL-4、GM-CSF及LPS联合诱导培养DC,实验分组:(A)DC-rh AAV/AFP、(B)DEXrh AAV/AFP、(C)DC-DEXrh AAV/AFP、(D)DC-Control,显微镜观察DC形态,流式细胞术检测DC表型。2.荧光显微镜及流式细胞术鉴定rh AAV/AFP感染DC的效率。3.超滤及蔗糖密度梯度超速离心法纯化DEX,透射电镜下观察DEX形态,Nano ZS90(Malvern)分析DEX粒径大小,Western blotting分析其功能蛋白及肝癌抗原分子的表达。4.分别用rh AAV/AFP、DEXrh AAV/AFP致敏DC前体细胞,制备抗原负载的DC。5.荧光显微镜及流式细胞术分析(A)DC-rh AAV/AFP、(B)DEXrh AAV/AFP、(C)DC-DEXrh AAV/AFP、(D)DC-Control剌激初始T细胞的增殖能力。比较DC(A)、DEX(B)及其二者联合应用(C)对效应细胞功能分子表达以及产生细胞因子的水平的影响,细胞毒实验7-AAD-PE/Annexin V-FITC双染法分析它们介导的抗原特异性杀伤效应。【结果】1.成熟DC(m DC)呈典型的树突状形态,表面分子CD83、CD1a、CD80、CD86的表达显着高于未成熟DC(im DC)(P<0.05),而CD209(ICAM-3)、HLA-DR的表达无差异(P>0.05)。2.rhAAV/AFP感染DC细胞后,荧光显微镜下DC细胞呈现绿色荧光,流式细胞术检测感染效率达到86%。3.m DC分泌的DEX为直径约50nm100nm圆形或椭圆形小体,表达外泌体膜相关标志分子:CD63、CD9,DC功能相关分子:ICAM-1、HLA-DR、CD86、HSP70分子及抗原AFP分子。4.DC-rh AAV/AFP(A)、DEXrh AAV/AFP(B)以及DC-DEXrh AAV/AFP(C)刺激初始T淋巴细胞增殖能力显着高于与无抗原负载的DC对照组(D)(P<0.05)。5.与对照组相比,DC-rh AAV/AFP、DEXrh AAV/AFP以及DC-DEXrh AAV/AFP刺激诱导的效应细胞的CD45RO、LFA-1a/CD244、Granzyme B、Perforin的表达水平显着增高(P<0.05)。DC-DEXrh AAV/AFP诱导的效应细胞的CD28、OX40、HLA-DR分子的表达显着高于DC-Control组(P<0.05)。CD45RA在DEXrh AAV/AFP及DC-DEXrh AAV/AFP组的表达水平显着低于DC-Control(P<0.05)。DC-DEXrh AAV/AFP组中PD-1的表达显着高于DC-Control和DC-rh AAV/AFP组(P<0.05)。CD69、CD71、CD95、CTLA-4等分子的表达四组无显着差异(P>0.05)。细胞因子检测结果显示DC-DEXrh AAV/AFP刺激CTL分泌IFN-γ水平显着高于对照组(P<0.05)。DEXrh AAV/AFP组与其他组相比,刺激CTL分泌IL-4和IL-17A水平显着降低(P<0.05)。6.三组实验组诱导的CTL对肝癌细胞的杀伤作用显着高于无抗原负载的DC对照组(P<0.05),且诱导的CTL对AFP阳性的Hep G2肝癌细胞系的杀伤率显着高于AFP阴性的SMMC-7721肝癌细胞(P<0.05)。DC-DEXrh AAV/AFP诱导的CTL对肝癌细胞的杀伤率略高于DC-rh AAV/AFP和DEXrh AAV/AFP组,而DEXrh AAV/AFP与DC-rh AAV/AFP诱导的CTL对肝癌细胞的杀伤率比较无显着差异(P>0.05)。【结论】1.以rh AAV为载体感染DC能高效介导AFP基因在DC的持续表达,促进DC有效递呈AFP并诱导有效的肝癌特异性CTL效应。2.超滤联合蔗糖密度梯度超速离心法分离的DEX,杂质少,结构清晰,是一种高效简便的外泌体制备方法。从m DC提取的DEX高表达DC的功能相关分子、外泌体标志分子及肿瘤抗原分子。3.DEX作为一种具有抗原提呈作用的非细胞疫苗,可刺激初始T淋巴细胞活化增殖发挥特异性抗肿瘤免疫应答,此作用在DC协同下显着增强。

黄静[8](2016)在《多靶点抗原肽自体免疫细胞治疗原发性肝细胞癌的临床安全性及免疫应答研究》文中研究指明研究背景及目的免疫治疗成为继手术、放疗、化疗后第四种治疗肿瘤尤其是晚期恶性肿瘤的治疗方法,免疫治疗按照机制的不同可以分为主动性与被动性(或称为过继性)免疫治疗两大类,主动免疫治疗如治疗前列腺癌的DC疫苗等;过继性免疫治疗,即将各种免疫效应细胞、细胞因子或单克隆抗体输入机体,直接介导抗肿瘤免疫反应。过继性细胞免疫治疗(adoptive cellular immunotherapy,ACI)是免疫治疗发展历程中的重要里程碑,迄今为止主要应用的细胞类型有肿瘤浸润淋巴细胞(Tumor Infiltrating Lymphocyte,TIL),树突状细胞-杀伤性T淋巴细胞(Dendritic cell,Cytotoxic T lymphocyte,DC-CTL)以及近年新出现的嵌合抗原受体的T淋巴细胞(Chimeric antigen receptors of T cells,CAR-T)等,尤其是 CAR-T 目前在白血病治疗中疗效肯定,对部分实体瘤患者的临床试验也取得令人鼓舞的效果。原发性肝癌是指发生于肝细胞或肝内胆管细胞的恶性肿瘤,其中发生于肝细胞的恶性肿瘤就是原发性肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)约占原发性肝癌的90%。确诊时,大多数HCC患者已达BCLC中晚期(80%),只有15.3%的是BCLC早期。根据目前的HCC治疗指南,早期的患者可以选择手术、肝移植、射频消融等根治性方法,而对于那么多的中晚期HCC患者来说,仅有化疗和索拉菲尼这两种姑息性治疗方法可选择,因此需要探索新的治疗方法造福于中晚期肝癌患者。近年来对原发性肝细胞癌患者也进行了一系列免疫治疗的试验,目的是评估免疫治疗技术治疗HCC的效果。本研究采用14种肿瘤抗原多肽负载DC(muture dendritic cells,mDCs)的技术,给HCC患者皮下注射DC,并培养诱导CTL(cytotoxic T lymphocytes)静脉回输HCC患者体内,旨在探索联合了主动免疫与被动免疫的多靶点抗原肽自体免疫细胞技术(Multiple Antigen Stimulating Cellular Therapy,MASCTTM)治疗HCC的安全性及诱发患者体内免疫应答的机理研究,为其临床推广应用提供依据。并初步探讨MASCTTM是否能给HCC患者带来临床获益。研究方法1、MASCTTM治疗原发性肝细胞癌患者的临床安全性研究回顾性分析2012年1月至2014年12月期间南方医院肝病中心收治的接受MASCTTM且治疗前的末次治疗(手术、化疗、放疗)结束至少一个月或以上,并且未接受其他免疫治疗的45例原发性肝细胞癌患者的临床资料。第0天分离患者外周血单个核细胞,其中贴壁细胞诱导培养为成熟DC,负载14种抗原肽,小部分mDCs第8天经患者腹股沟淋巴结周围区皮下注射;未贴壁细胞第7天与大部分mDCs共培养诱导为CTL,第26天经静脉回输患者体内,对回输的DC及CTL进行细胞表型及细胞因子分泌检测。分析输注细胞后的不良反应的临床表现、血常规、肝肾功能变化。2、MASCTTM诱导原发性肝细胞癌患者体内免疫应答研究分为回顾性和前瞻性免疫应答机理研究,回顾性机理研究对象为未曾接受MASCTTM治疗与接受多次MASCTTM治疗的原发性肝细胞癌患者,采集原发性肝细胞癌患者外周血分离并获取单个核细胞,对比分析治疗前后T细胞亚群(流式细胞术)、特异性T细胞增殖(EdU检测)以及多靶点肿瘤抗原特异性免疫应答(ELISPOT检测)变化情况;前瞻性机理研究对象是随机纳入临床试验的不接受MASCTTM治疗的对照组和接受MASCTTM治疗的试验组的根治术后的HCC患者,同样对比两组之间T细胞亚群(流式细胞术)、特异性T细胞增殖(EdU检测)以及肿瘤抗原特异性免疫应答变化。分析体内免疫应答的情况,分别进行以下检测:1)T细胞亚群检测(流式细胞术):将分离得到的PBMC预处理后收集细胞悬液并离心,按照流式细胞染色实验步骤进行染色,染色方案为NKT(CD3+CD56+);CD8+NKG2D+Granzyme B+CD107a+;Treg(CD4+CD25+FoxP3+);CD45RO-FITC CD27-Percp-Cy5.5 CD57-APC CCR7-PE CD3-APC-Cy7,最后用FACS CantoⅡ流式细胞仪上机检测。2)抗原特异性T细胞增殖(EdU染色方法)及IFN-y水平测定(流式细胞术):将分离得到的PBMC给予无关肽、肝癌多靶点抗原肽库及细胞因子预刺激处理3天后收集细胞悬液并离心,按照流式细胞染色实验步骤进行染色,增殖实验染色方案为CD3-PE EdU-FITC;IFN-γ分泌检测染色方案为:CD8-APC-Cy7 CD4-PE CD27-PerCP-Cy5.5 CD28-FITC IFN-y-APC。最后用 FACS CantoⅡ流式细胞仪上机检测各类细胞比例。计算肽库组检测值/无关肽检测值的倍数。3)各肿瘤抗原肽特异性免疫应答检测(ELISPOT方法):将分离得到的PBMC分别给予无关肽、肝癌多靶点抗原肽库、各类抗原单条肽预刺激处理3天后,按照酶联免疫斑点检测方法(ELISPOT方法)进行检测,晾干板,用 ELISpotreader(AID EliSpot Reader classic)检测并统计斑点数。计算目标肽斑点数/无关肽斑点数的倍数。3、MASCTTM治疗原发性肝细胞癌临床效应的初步探究选取2012年1月之后确诊为原发性肝细胞癌BCLC分期B期并在南方医院肝病中心规律接受治疗(包括传统治疗和/或MASCTTM治疗),且定期返回南方医院进行复查随访的患者为研究对象,根据RECIST评估标准,回顾性比较接受传统治疗联合多次MASCTTM治疗(≥3次)和只接受传统治疗的BCLC分期B期的原发性肝细胞癌患者1年内疾病进展情况(disease control rate,DCR),初步探索MASCTTM免疫治疗能否控制HCC疾病发展。4、统计学分析应用SPSS19.0统计软件进行统计学分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示,多次重复测量均数比较采用单因素重复测量资料方差分析。计数资料组间两两比较用卡方检验或Fisher’s精确检验。作图用GraphPad Prism软件。P<0.05有显着统计学差异。研究结果1、MASCTTM成功诱导培养mDC和CTL,MASCTTM治疗后患者不良反应少纳入的45例原发性肝细胞癌患者中男性43例,女性2例,年龄30-65岁,平均年龄53.78岁。大约91.1%患者合并慢性乙型肝炎病毒(88.9%)或慢性丙型肝炎病毒(2.2%)感染。按照Child-Pugh评分标准,45例原发性肝细胞癌患者肝功能均为A级(57.8%)或B级(42.2%),按照巴塞罗那临床肝癌(Barcelona Clinic Liver Cancer,BCLC)分期标准,其中A期7例,B期13例,C期19例,D期6例。45例患者中,14例接受过手术切除治疗(31.1%),33例曾行肝动脉栓塞术(73.2%),10例进行过射频消融术(22.2%),45例患者接受MASCTTM治疗次数为1至10次不等(平均治疗3.78次/人)。MASCTTM培养的mDCs中CD80+细胞比例为(98.5±5)%、CD83+细胞为(88±10)%、CD86+细胞为(98.4±3)%,HLA-DR+细胞为(98.8±2)%,mDCs 分泌高水平 IL-12(985±312 pg/ml),低水平IL-10(53±10 pg/ml)。CTL 中 CD3+CD8+细胞为(83±10)%,CD3+CD56+细胞为(24±5)%。CTL 分泌高水平 IFN-y(1222±650 pg/ml),低水平IL-10(6.8±5.0 pg/ml)。MASCTTM治疗后,绝大多数患者的精神、食欲、睡眠、体力较前好转,有2名(4.44%)患者在输注CTL细胞1h后出现轻中度发热,未观察到其他严重明显不良反应。患者的血常规、肾功能均无明显异常变化,肝功能有轻度升高趋势。未发现与MASCTTM相关的死亡事件。2、多次MASCTTM治疗后改善原发性肝细胞癌患者体内免疫抑制状况,诱导特异性免疫应答多次MASCTTM治疗组的患者外周血NKT(CD3+CD56+)比例上调、Treg(CD4+CD25+FoxP3+)下调、共表达杀伤相关分子(NKG2D,Granzyme B,CD 107a)的CD8+T细胞比例上调,效应T细胞(effect T cell,Te)、中央记忆性T细胞(center memory T cell,Tcm)比例也明显上调。在体外将PBMC分别用HCC抗原肽库和无关肽刺激培养后检测T细胞的增殖能力(EdU检测方法)和分泌IFN-r的能力(流式细胞术)以及对各个肿瘤抗原的特异性应答(ELISPOT检测方法),多次MASCTTM治疗的HCC患者外周血中T细胞增殖能力、分泌IFN-γ的能力均显着提高且T细胞对HCC抗原肽库产生了应答,不同患者对肝癌多靶点抗原肽库中不同单肽产生不同程度应答。3、MASCTTM治疗+传统治疗的BCLC B期原发性肝细胞癌患者1年内疾病控制率为80%纳入研究的32名BCLC分期B期HCC患者,其中有15名接受多次MASCTTM治疗(≥3次),有17名接受了传统治疗,观察分析并比较接受传统治疗联合多次MASCTTM治疗组患者1年内疾病进展情况(disease control rate,DCR)与只接受传统治疗的原发性肝细胞癌患者,接受了多次MASCTTM治疗的HCC患者1年内的疾病控制率为80%,传统标准治疗组为17.65%。研究结论1、本研究表明MASCTTM治疗原发性肝细胞癌患者不良反应较少,临床应用安全性良好,可为其临床推广应用提供依据。2、MASCTTM治疗技术可改善HCC患者体内免疫抑制状态,诱导针对肿瘤抗原肽的特异性免疫应答,可对肽库中不同的抗原肽产生特异性免疫应答,且会随着治疗次数的增加而增强应答。3、MASCTTM治疗HCC的临床疗效还有待临床试验的研究结果。

黄胜兰[9](2014)在《AFP基因修饰的DC细胞的分泌的exosome抗肿瘤作用研究》文中进行了进一步梳理【目的】原发性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是中国常见的恶性肿瘤之一。由于肝癌起病隐匿,缺乏有效的早期诊断方法,而且复发率高、预后差,因而总的治疗效果并不理想,目前肝癌生物治疗逐渐成为研究热点之一。其中,树突状细胞(dendritic cell,DC)疫苗的实验研究已取得相当大的进展,然而在实际应用仍存在很多不足,效果往往不如预期理想,其中缺乏有效抗原刺激是重要的影响因素之一,为此众多学者尝试运用不用抗原负载方式增强DC疫苗诱导抗肿瘤免疫反应,这其中包括人工合成的抗原肽、全肿瘤裂解物、基因载体转染DC等等,虽然基因转染DC可在一定程度上解决抗原来源问题,但基因载体在人体应用的安全性未能得到保障,因此最近人们尝试用新型亚细胞瘤苗exosome等来调节或替代DC功能。Exosome是DC细胞分泌一种膜性囊泡,其重要特性是携带DC细胞的各种功能蛋白,因而具有相应的诱导主动免疫应答功能,其抗肿瘤作用已经在非小细胞肺癌、黑色素瘤等治疗中取得一定的效果,但应用于肝癌的研究尚处于探索阶段。本实验首先构建携带AFP基因慢病毒质粒,包装成慢病毒感染DC,分离纯化DC分泌的exosome,分析exosome的特异性抗肿瘤免疫作用。为开拓新型非细胞性肝癌疫苗提供实验依据,避免直接病毒基因导入人体,以便研制出更具临床应用前景的肿瘤疫苗。【方法】1.应用慢病毒质粒系统和包装细胞Lenti-X293T,构建包装能使AFP稳定表达的重组慢病毒颗粒。2.取健康人外周血,分离培养单核细胞,用细胞因子rhGM-CSF、rhIL-4及LPS诱导培养DC,显微镜下观察细胞形态,流式细胞仪鉴定DC表型。3.分别用合成的已知序列的AFP肽、肝癌细胞株HepG2反复冻融全抗原、携带AFP重组慢病毒颗粒负载DC,分别制备DC疫苗。4.用超滤及密度梯度离心法提取纯化DC分泌的exosome,制备exosome疫苗,透射电镜下观察exosome形态,western blot分析其功能蛋白分子。5. WST-1法比较三种DC疫苗、exosome疫苗刺激T淋巴细胞增殖情况,LDH法比较三种DC疫苗、exosome疫苗诱导的CTL对HepG2特异性细胞毒效应,ELLSA法比较DC疫苗、exosome疫苗活化T淋巴细胞培养上清中分泌INF-γ的浓度。6.将携带AFP抗原的exosome致敏DC,WST-1法、LDH法、ELISA法检测DC抗肿瘤免疫学活性。【结果】1.成功构建了慢病毒表达载体PRV3-AFP,能有效的感染树突状细胞并使其分泌AFP蛋白。2.mDC成典型的树突状细构,表面HLA-DR、CD80、CD83、CD86、CD1a分子的表达明显高于imDC。3.成熟DC分泌的exosome(Dex)在电镜下为直径在50nm-100nm之间圆形或椭圆形小体,携带与DC功能相关的分子:ICAM-1、HLA-DR、CD86分子。4.慢病毒感染的DC刺激T淋巴细胞增殖能力显着高于AFP肽、全抗原处理组(P<0.05),前者刺激T淋巴细胞分泌IFN-γ和对肝癌细胞HepG2特异性杀伤作用显着高于其他两组(P<0.05)。5.慢病毒处理组制备的DC疫苗和其分泌exosome疫苗比较,exosome疫苗刺激T淋巴细胞增殖能力和诱导的T细胞对HepG2细胞特异性杀伤能力稍强于DC疫苗(P<0.05),exosome疫苗刺激T细胞分泌IFN-γ能力和与DC疫苗比较差别无显着意义(P>0.05)。6. exosome致敏的DC能更有效的刺激T淋巴细胞增殖和产生细胞毒作用。【结论】1.成功构建AFP慢病毒,慢病毒负载DC和AFP肽、细胞裂解抗原负载方式比较能更有效的诱导抗肿瘤免疫,是一种更为有效的制备DC疫苗方式。2. Dex作为一种具有抗原提呈能力的亚细胞结构,可诱导外周血中T细胞增殖并发挥特异性抗肿瘤作用。exosome致敏的DC能产生更有效的抗肿瘤免疫作用。

金洪娟[10](2011)在《MAGE-1短肽体外免疫效应的实验研究》文中研究说明目前对恶性肿瘤的治疗主要方法包括手术治疗、放射治疗和化学治疗。手术治疗仍是目前最常用于恶性肿瘤治疗的手段,对于许多早期局部发生的肿瘤有着良好的治疗效果。但是在弥漫性发生的恶性肿瘤(如白血病,晚期肿瘤广泛转移等)、重要器官浸润生长的恶性肿瘤、远处发生隐匿转移的恶性肿瘤则治疗效果较差甚至无法进行手术治疗。放射治疗和化学治疗对正常组织亦会有杀伤从而产生较大的副作用;肿瘤耐药性的产生对化学治疗的应用也有了较大的限制。总之,应用现有的治疗手段治疗恶性肿瘤不能令人满意。近年来,随着分子生物学、免疫学的发展,人们对恶性肿瘤的生物学行为有了更加深刻的认识。恶性肿瘤是一种基因相关疾病,恶性肿瘤细胞和正常组织细胞既有着相似性和同源性,又有异质性。与正常细胞相比较,肿瘤细胞无论在形态结构、生化组成或代谢功能等方面都发生了很大的改变,而在结构上发生改变的糖蛋白或糖脂分子可以成为肿瘤细胞的新抗原,即肿瘤抗原(tumor antigen)。其中有些抗原分子为某种肿瘤所特有,而在正常组织细胞中无表达,称为肿瘤特异性抗原(tumor specific antigen,TSA)。TSA可刺激机体的免疫系统产生针对该细胞的特异性的免疫反应过程。机体的抗肿瘤效应分为细胞免疫应答及体液免疫应答,而前者起主要作用,其效应细胞为T淋巴细胞,在抗原递呈细胞(APC)递呈的刺激下可诱导产生针对表达该抗原的肿瘤细胞特异性的细胞毒性反应,即CTL效应,同时对正常组织无损伤。APC将抗原加工递呈到细胞表面,与MHC分子形成抗原肽(9-14个aa)-MHC复合体递呈给T细胞,使之活化,发挥抗瘤效应。肿瘤免疫治疗正是利用了这些理论所采取的策略。黑色素瘤相关抗原(MAGE)最早在1991年被学者发现的,它是从人黑色素瘤细胞系(MZ2)分离出的抗原,可以被细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)所识别。而后的数年间,更多种新的MAGE基因被发现,共称为MAGE基因家族,该家族成员的共有特点:定位于X染色体;拥有开放阅读框(open reading frame,ORF),该基因编码的蛋白质C末端含有约200个氨基酸残基的同源序列;在黑色素瘤及其他多种恶性肿瘤均有不同程度的表达,而在除外睾丸和胎盘以外的正常组织中无表达。因其高度的特异性,MAGE蛋白作为抗肿瘤免疫的靶抗原,为肿瘤的特异性免疫治疗提供新的方法和途径。许多学者应用MAGE作为肿瘤治疗的靶抗原进行了大量的研究工作,在相当一部分恶性肿瘤的实验治疗中取得了满意的效果。为增强肿瘤疫苗的免疫效果,不同的学者针对肿瘤疫苗免疫过程中的不同环节做了大量的研究工作。随着基因工程技术和免疫学的发展,人们已可以对抗原氨基酸序列进行分析研究,测定抗原表位,并精确地确定了决定免疫功能的特定序列。在肿瘤抗原改造方面,近期的研究主要集中在优势表位的筛选和组合。因为机体免疫系统产生的肿瘤免疫应答主要依靠细胞免疫,作为主要的效应细胞CD8+的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)因其能特异性的识别并直接杀死肿瘤细胞而受到更多的关注。因此,改善肿瘤疫苗的设计方案之一,就是在疫苗中包括这些能够诱导CTL效应的MHC II类分子限制的抗原表位。有进一步的实验发现,单一的抗原表位不能诱导T淋巴细胞产生出足够强度的杀伤效应,因此有人尝试在同一载体内负载多个抗原表位的方法,因此本文所选择的目的基因正是覆盖了三个个高亲和力的抗原表位进行实验,探讨其作为肿瘤免疫治疗的可行性。实验首先于体外合成该短肽片段(EADPTGHSY),冲击树突状细胞后与淋巴细胞共混获得效应细胞,应用MTT法观察其对肿瘤细胞生长的抑制作用。以野生型癌株作为靶细胞,应用MTT法及LDH方法观察其对淋巴细胞增殖及CTL效应的影响。实验结果表明MAGE-1短肽致敏的树突状细胞可激活T淋巴细胞,产生抑瘤效应。为MAGE-1短肽疫苗的抗瘤研究奠定了基础。本研究进一步应用PCR技术从人基因组中得到DNA片段,构建重组表达MAGE121-169质粒载体,在原核表达体系中诱导表达。经Westren Blot杂交鉴定、镍凝胶亲和层析法纯化目的蛋白。3H掺入法检测目的短肽诱导的小鼠淋巴细胞增殖反应。MTT法检测其对T细胞免疫活性的影响。结果显示MAGE-1127-169短肽在大肠杆菌中以包涵体形式表达。Western-blot检测收获的表达产物证实为所需的目的蛋白。与淋巴细胞共孵育后测得的淋巴细胞增殖指数明显增加。首选经该短肽致敏树突状细胞,与T细胞作用后,活化的T淋巴细胞可明显抑制肿瘤细胞的生长。结果提示本研究成功诱导了MAGE-1127-169短肽的原核表达,获得纯度较高的MAGE-1121-169短肽,掌握了该短肽的表达和纯化的最适条件,同时证明在一定浓度下目的短肽可于体外诱导小鼠的特异性淋巴细胞增殖,并产生有效的CTL效应。提示了存在多个抗原表位MAGE-1121-169短肽可更好的诱导淋巴细胞增殖,诱导产生CTL效应,具有良好的免疫原性,可作为肿瘤治疗的靶点。

二、MAGE-3抗原肽体外诱导肝癌患者免疫应答的研究(论文开题报告)

(1)论文研究背景及目的

此处内容要求:

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例:

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

(2)本文研究方法

调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、MAGE-3抗原肽体外诱导肝癌患者免疫应答的研究(论文提纲范文)

(1)载黄芩苷多功能纳米粒构建及抗肿瘤研究(论文提纲范文)

摘要
Abstract
1 绪论
    1.1 引言
    1.2 黄芩的概述
        1.2.1 黄芩的形态学特征
        1.2.2 黄芩的资源分布
        1.2.3 黄芩中的活性成分
    1.3 黄芩苷的概述
        1.3.1 黄芩苷的药理活性
        1.3.2 黄芩苷的物理性质
        1.3.3 难溶药物增溶策略
    1.4 难溶药物纳米递送系统研究概述
        1.4.1 聚合物纳米粒
        1.4.2 脂质体纳米粒
        1.4.3 胶束颗粒
    1.5 载黄芩苷纳米粒的抗肿瘤研究
        1.5.1 载黄芩苷纳米粒的化学治疗
        1.5.2 载黄芩苷纳米粒的免疫治疗
    1.6 肿瘤免疫治疗的复合纳米制剂概述
        1.6.1 肿瘤免疫
        1.6.2 基于纳米制剂的免疫抗肿瘤
    1.7 本研究的目的及意义
2 载黄芩苷PLGA纳米粒制备与佐剂效应评价
    2.1 引言
    2.2 实验仪器、材料与试剂
        2.2.1 实验仪器
        2.2.2 实验材料与试剂
    2.3 实验方法和步骤
        2.3.1 载黄芩苷纳米粒的制备
        2.3.2 纳米粒的形貌表征
        2.3.3 纳米粒对髓源树突状细胞(BMDCs)的活化水平评价
        2.3.4 纳米粒体外抗肿瘤效果评价
        2.3.5 数据统计与分析
    2.4 实验结果与讨论
        2.4.1 载黄芩苷纳米粒制备条件优化
        2.4.2 载黄芩苷纳米粒的制备和表征
        2.4.3 黄芩苷和PLGA-B的体外细胞毒性分析
        2.4.4 载黄芩苷纳米粒免疫细胞激活
        2.4.5 载黄芩苷纳米粒体外抗肿瘤效果
    2.5 本章小结
3 载黄芩苷仿生纳米粒的构建及效应评价
    3.1 引言
    3.2 实验仪器、材料与试剂
        3.2.1 实验仪器
        3.2.2 实验材料与试剂
    3.3 实验方法与步骤
        3.3.1 载黄芩苷仿生纳米粒的制备
        3.3.2 载黄芩苷仿生纳米粒的表征
        3.3.3 载黄芩苷仿生纳米粒细胞水平评价
        3.3.4 载黄芩苷仿生纳米粒动物水平评价
        3.3.5 数据统计和分析
    3.4 实验结果与讨论
        3.4.1 载黄芩苷仿生纳米粒的制备与表征
        3.4.2 载黄芩苷仿生纳米粒的细胞摄取和细胞毒性
        3.4.3 载黄芩苷仿生纳米粒对TAMs的体外刺激作用
        3.4.4 NPs@RBC-Gala有效靶向体内肿瘤部位
        3.4.5 体内TAMs表型分析
        3.4.6 肿瘤部位的T淋巴浸润
        3.4.7 载黄芩苷仿生纳米粒的体内抗肿瘤效应
    3.5 本章小结
4 靶向M2-TAMs载黄芩苷复合纳米粒的构建及体外抗肿瘤效应
    4.1 引言
    4.2 实验仪器、材料与试剂
        4.2.1 实验仪器
        4.2.2 实验材料与试剂
    4.3 实验方法与步骤
        4.3.1 靶向M2-TAMs载黄芩苷复合纳米粒的制备
        4.3.2 复合纳米粒的表征
        4.3.3 复合纳米粒细胞水平评价
        4.3.4 实验数据统计与分析
    4.4 实验结果与讨论
        4.4.1 复合纳米粒的制备与表征
        4.4.2 复合纳米粒体外诱导巨噬细胞极化
        4.4.3 体外抗肿瘤活性
    4.5 本章小结
5 靶向M2-TAMs载黄芩苷复合纳米粒的体内抗肿瘤效应
    5.1 引言
    5.2 实验仪器、材料与试剂
        5.2.1 实验仪器
        5.2.2 实验材料与试剂
    5.3 实验方法与步骤
        5.3.1 复合纳米粒的制备
        5.3.2 复合纳米粒的表征
        5.3.3 体内生物安全性评价
        5.3.4 靶向M2-TAMs载黄芩苷复合纳米粒的体内靶向能力
        5.3.5 靶向M2-TAMs载黄芩苷复合纳米粒的体内抑瘤效应
        5.3.6 实验动物
        5.3.7 数据统计与分析
    5.4 实验结果与讨论
        5.4.1 复合纳米粒的生物安全性
        5.4.2 靶向M2-TAMs载黄芩苷复合纳米粒能有效靶向M2-TAMs
        5.4.3 复合纳米粒治疗后体内TAMs表型逆转
        5.4.4 复合纳米粒增加了TAMs细胞因子分泌
        5.4.5 复合纳米粒诱导肿瘤微环境中免疫细胞浸润
        5.4.6 复合纳米粒的体内抗肿瘤效应
        5.4.7 复合纳米粒抑制肿瘤部位的肿瘤新生血管生成
        5.4.8 复合纳米粒抑制肿瘤细胞侵袭和转移
        5.4.9 复合纳米粒的预防抗肿瘤效应
    5.5 本章小结
结论
参考文献
附录
攻读学位期间发表的学术论文
致谢

(2)基于TCGA数据库筛选点突变肿瘤新抗原诱导特异性CTL的研究(论文提纲范文)

摘要
abstract
前言
第一章 基于TCGA数据库筛选点突变肿瘤新抗原
    引言
    1.1 实验材料
    1.2 实验方法
        1.2.1 筛选点突变肿瘤新抗原
        1.2.2 SYFPEITHI,BIMAS等预测系统评估抗原表位肽的免疫呈递能力
        1.2.3 KRAS G12V,TP53 R158L,CTNNB1 R158L相关生存曲线的比较
        1.2.4 基于TCGA的数据探讨KRAS G12V,TP53 R158L,CTNNB1 K335I突变在癌症中的影响
    1.3 结果
        1.3.1 结合TCGA数据库筛选抗原表位肽
        1.3.2 SYFPEITHI,BIMAS等预测系统评估抗原表位肽的免疫呈递能力
        1.3.3 KRAS G12V,TP53 R158L,CTNNB1 K335I相关生存曲线的比较分析
        1.3.4 基于TCGA的数据探讨KRAS G12V,TP53 R158L,CTNNB1 K335I突变在癌症中的影响
    1.4 小结
第二章 初步检测点突变抗原表位肽的免疫原性
    引言
    2.1 实验材料
        2.1.1 细胞系
        2.1.2 健康人外周血的样本采集
        2.1.3 实验材料的合成
        2.1.4 实验试剂
        2.1.5 主要仪器
    2.2 实验方法
        2.2.1 验证抗原表位肽与HLA-A2分子的亲和力
        2.2.2 体外诱导表位肽特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)
        2.2.3 树突状细胞的形态学观察及表型检测
        2.2.4 CTL细胞的形态学观察及CFSE检测细胞增殖
        2.2.5 抗原特异性T淋巴细胞的亚群检测
        2.2.6 ELISA检测抗原表位肽体外刺激特异性T淋巴细胞的IFN-r分泌情况
        2.2.7 钙黄绿素法初步检测肽诱导刺激特异性CTL的杀伤活性
    2.3 结果
        2.3.1 免疫抗原表位肽与HLA-A2分子的亲和力检测
        2.3.2 DC细胞形态学观察及流式检测细胞表型
        2.3.3 特异性CTL细胞的形态学观察及CFSE检测细胞增殖情况
        2.3.4 流式检测抗原特异性T淋巴细胞亚群
        2.3.5 抗原表位肽体外刺激特异性T细胞的IFN-r分泌情况
        2.3.6 初步检测抗原肽诱导的特异性CTL对负载肽的T2细胞杀伤活性
    2.4 小结
第三章 点突变抗原表位肽体外诱导特异性CTL的抗肿瘤效果
    引言
    3.1 实验材料
        3.1.1 细胞系
        3.1.2 健康人外周血的样本采集
        3.1.3 实验材料的合成
        3.1.4 实验试剂
        3.1.5 实验仪器
    3.2 实验方法
        3.2.1 流式检测健康人外周血样本及肿瘤细胞的HLA分型
        3.2.2 构建KRAS-G12V-pIRES2-EGFP、TP53-R158L-pIRES2-EGFP、CTNNB1-K335I-pIRES2-EGFP重组真核表达质粒
        3.2.3 重组质粒转染肿瘤细胞及流式检测转染效率
        3.2.4 RT-qPCR检测突变基因在肿瘤细胞中的表达
        3.2.5 镜下观察CTL对肿瘤细胞杀伤作用的显微结构
        3.2.6 钙黄绿素检测特异性CTL对肿瘤细胞的杀伤作用
        3.2.7 CFSE-PI染色法检测特异性CTL对肿瘤细胞的细胞毒作用
        3.2.8 流式检测CTL细胞杀伤肿瘤细胞颗粒霉素B的表达情况
        3.2.9 ELISA检测CTL细胞裂解肿瘤细胞IFN-γ和穿孔素的分泌情况
        3.2.10 统计学分析
    3.3 结果
        3.3.1 流式检测健康人外周血样本及肿瘤细胞的HLA分型
        3.3.2 构建KRAS G12V-pIRES2-EGFP,TP53 R158L-pIRES2-EGFP,CTNNB1 K335I-pIRES2-EGFP重组真核表达质粒
        3.3.3 重组质粒转染肿瘤细胞及流式检测转染效率
        3.3.4 RT-qPCR检测突变基因在肿瘤细胞的表达情况
        3.3.5 CTL细胞对肿瘤细胞杀伤作用的显微结构观察
        3.3.6 钙黄绿素法检测肽诱导特异性CTL对野生型与突变型肿瘤细胞的细胞毒作用
        3.3.7 CFSE-PI染色法检测特异性CTL对肿瘤细胞的细胞毒作用
        3.3.8 流式检测CTL细胞杀伤肿瘤细胞颗粒霉素B的表达情况
        3.3.9 ELISA检测CTL细胞裂解肿瘤细胞IFN-γ和穿孔素的分泌情况
    3.4 小结
第四章 点突变肽诱导T细胞前后TCR家族CDR3 谱型的初步分析
    引言
    4.1 实验材料
        4.1.1 实验样本
        4.1.2 实验试剂
        4.1.3 实验仪器
    4.2 实验方法
        4.2.1 提取样本细胞RNA
        4.2.2 反转录1st-Strand cDNA
        4.2.3 多重PCR扩增样本T细胞中TCR Vα和 Vβ链的CDR3 区基因片段
    4.3 结果
        4.3.1 STR扫描检测CTNNB1 突变肽诱导特异性T细胞前后TCR基因Vα链 CDR3 区的基因表达情况
        4.3.2 STR扫描检测CTNNB1 突变肽诱导特异性T细胞前后TCR基因Vβ链 CDR3 区的基因表达情况
    4.4 小结
第五章 讨论与总结
    5.1 讨论
参考文献
附录一 英文缩略词表
附录二 质粒图谱
附录三 攻读学位期间发表的论文
致谢

(3)胶质瘤相关抗原MAGE-D4 T细胞抗原肽的预测和鉴定(论文提纲范文)

英文缩略词索引
摘要
ABSTRACT
前言
绪论
实验设计方案
材料方法
结果
讨论
结论
参考文献
综述
    参考文献
致谢

(4)CpG ODN协同MAGE-3抗原肽致敏DC疫苗对膀胱癌细胞BIU-87的抑制作用(论文提纲范文)

1 材料与方法
    1.1 细胞和主要试剂
    1.2 人DC的培养及鉴定
    1.3 T淋巴细胞的制备
    1.4 DC的抗原致敏
    1.5 MTT法检测致敏DC对T淋巴细胞增殖率的影响
    1.6 流式细胞术检测CTL对BIU-87细胞的杀伤作用
    1.7 MAGE疫苗和/或Cp G ODN对裸鼠移植瘤生长的影响
    1.8 MTT法检测荷瘤小鼠脾脏单个核细胞和膀胱移植瘤细胞的增殖情况
    1.9 Western blotting法测定荷瘤小鼠瘤组织细胞凋亡蛋白的变化
    1.1 0 统计学处理
2 结果
    2.1 致敏DC表面CD83、CD86和CD80阳性表达率明显提高
    2.2 致敏DC疫苗致T淋巴细胞的增殖能力明显增强
    2.3 致敏DC疫苗明显提高CTL杀伤膀胱癌细胞BIU-87的活性
    2.4 致敏DC疫苗明显抑制裸鼠BIU-87移植瘤的生长
    2.5 致敏DC疫苗明显促荷瘤小鼠脾脏中单个核细胞的增殖率
    2.6 致敏DC明显抑制BIU移植肿瘤组织细胞的增殖能力
    2.7 MAGE-3+Cp G ODN致敏DC诱导CTL杀伤BIU细胞后Bax/Bcl-2蛋白表达水平变化
3 讨论

(5)个体化新抗原鉴定及其在晚期恶性实体肿瘤免疫治疗中的应用(论文提纲范文)

摘要
Abstract
第一章 绪论
    一、传统的精准医疗模式所面临的问题
    二、免疫治疗有望克服传统精准医疗模式存在的缺陷
    三、以新抗原为基础的个体化免疫治疗有望成为精准医疗的突破口
    四、个体化新抗原鉴定及应用的研究现状
    五、我们的设计
    参考文献
第二章 靶向捕获测序指导下的个体化新抗原鉴定及在恶性实体瘤中的应用
    1. 前言
    2. 材料与方法
    3. 结果
    讨论
    5. 结论
    附加材料
    参考文献
第三章 新抗原肽库构建及其在恶性实体瘤个体化免疫治疗中的应用
    1. 前言
    2. 材料与方法
    3. 结果
    4. 讨论
    5. 结论
    附加材料
    参考文献
博士研究生期间学习情况
博士研究生期间科研成果
致谢

(6)多靶点抗原肽自体免疫细胞治疗原发性肝细胞癌的免疫应答研究及联合TACE的临床疗效(论文提纲范文)

摘要
ABSTRACT
前言
    参考文献
第一章 多靶点抗原肽自体免疫细胞治疗技术诱导原发性肝细胞癌患者体内免疫应答研究
    1 材料与方法
    2 结果
    3 讨论
    参考文献
第二章 多靶点抗原肽自体免疫细胞联合TACE治疗原发性肝细胞癌
    1 材料与方法
    2 结果
    3 讨论
    参考文献
全文总结
    1 主要发现
    2 不足和展望
攻读硕士期间成果
致谢

(7)rhAAV/AFP感染DC分泌的Exosome诱导抗肝癌特异性T细胞的免疫效应研究(论文提纲范文)

附录
中文摘要
英文摘要
前言
第一部分:AFP抗原不同方式负载DC体外诱导抗肝癌效应比较
    引言
    1. 材料和方法
    2. 结果
    3. 讨论
第二部分:DEX的制备及分析鉴定
    引言
    1. 材料和方法
    2. 结果
    3. 讨论
第三部分:rh AAV/AFP感染DC分泌的Exosome体外诱导抗肝癌特异性T细胞免疫效应研究
    引言
    1. 材料和方法
    2. 结果
    3. 讨论
结论
参考文献
综述
    参考文献
致谢

(8)多靶点抗原肽自体免疫细胞治疗原发性肝细胞癌的临床安全性及免疫应答研究(论文提纲范文)

摘要
ABSTRACT
前言
    参考文献
第一章 多靶点抗原肽自体免疫细胞治疗原发性肝细胞癌的临床安全性研究
    1 材料和方法
    2 结果
    3 讨论
    4 参考文献
第二章 多靶点抗原肽自体免疫细胞诱导原发性肝细胞癌患者体内免疫应答研究
    1 材料和方法
    2 结果
    3 讨论
    4 参考文献
第三章 多靶点抗原肽自体免疫细胞治疗原发性肝细胞癌临床疗效初步探究
    1 材料和方法
    2 结果
    3 讨论
    4 参考文献
全文总结
攻读硕士学位期间成果
致谢

(9)AFP基因修饰的DC细胞的分泌的exosome抗肿瘤作用研究(论文提纲范文)

英文缩略词表
中文摘要
Abstract
前言
第一部分:AFP 慢病毒表达载体的构建与包装
    材料与方法
    结果
    讨论
第二部分:AFP 抗原以不同方式修饰 DC 体外诱导抗肿瘤作用的实验研究
    材料与方法
    结果
    讨论
第三部分:AFP 基因修饰 DC 分泌的 exosome 体外诱导抗肿瘤作用的实验研究
    材料与方法
    结果
    讨论
结论
参考文献
致谢
综述
    参考文献

(10)MAGE-1短肽体外免疫效应的实验研究(论文提纲范文)

中文摘要
Abstract
第1章 综述
    1.1 肿瘤疫苗
        1.1.1 细胞疫苗
        1.1.2 核酸疫苗
        1.1.3 肽疫苗
    1.2 MAGE 基因家族
        1.2.1 MAGE 的分类与结构
        1.2.2 MAGE 的结构、定位和表达
        1.2.3 MAGE 基因的生物学功能
        1.2.4 MAGE 基因与肿瘤的免疫治疗
第2章 MAGE-1 九肽免疫原性体外实验
    2.1 材料和方法
        2.1.1 实验材料及仪器
        2.1.2 实验方法
        2.1.3 统计学方法
    2.2 实验结果
        2.2.1 细胞形态学观察
    2.3 讨论
    2.4 小结
第3章 MAGE-1_(121-169)短肽表达载体的构建及鉴定
    3.1 材料和方法
        3.1.1 实验试剂与设备
        3.1.2 试剂配制
    3.2 方法
        3.2.1 目的基因的获得
        3.2.2 重组质粒构建
    3.3 结果
        3.3.1 mRNA OD 值的测定
        3.3.2 RT-PCR 扩增产物
        3.3.3 酶切分析结果
        3.3.4 测序分析
    3.4 讨论
    3.5 小结
第4章 MAGE-1_(121-169)短肽体外免疫活性研究
    4.1 材料和方法
        4.1.1 实验材料和仪器
        4.1.2 主要仪器
    4.2 实验方法
        4.2.1 MAGE-1_(_(121-169)) 重组质粒的构建和鉴定
        4.2.2 重组菌的表达
        4.2.3 表达条件的优化
        4.2.4 MAGE-1_(121-169) 蛋白产物分析
        4.2.6 表达产物的纯化
        4.2.7 表达产物的 Western-blot 分析
        4.2.8 表达产物定量
        4.2.9 MAGE121-169短肽免疫活性性检测
    4.3 结果
        4.3.1 重组原核表达载体的转化和鉴定
        4.3.2 重组菌的筛选
        4.3.3 诱导物浓度的优化
        4.3.4 诱导表达时间的优化
        4.3.5 表达蛋白定位分析
        4.3.6 目的蛋白纯化及定量
        4.3.7 Western blot 分析
        4.3.8 免疫活性检测
    4.4 讨论
    4.5 小结
结论
参考文献
作者简介及在学期间所取得的科研成果
致谢

四、MAGE-3抗原肽体外诱导肝癌患者免疫应答的研究(论文参考文献)

  • [1]载黄芩苷多功能纳米粒构建及抗肿瘤研究[D]. 韩淑兰. 东北林业大学, 2020
  • [2]基于TCGA数据库筛选点突变肿瘤新抗原诱导特异性CTL的研究[D]. 吴婉文. 广东药科大学, 2020(01)
  • [3]胶质瘤相关抗原MAGE-D4 T细胞抗原肽的预测和鉴定[D]. 李申奥. 广西医科大学, 2019(08)
  • [4]CpG ODN协同MAGE-3抗原肽致敏DC疫苗对膀胱癌细胞BIU-87的抑制作用[J]. 李秀真,薛庆节,路海,聂尚丹,王晖,李运清,赵龙玉,谭文彬. 中国肿瘤生物治疗杂志, 2018(09)
  • [5]个体化新抗原鉴定及其在晚期恶性实体肿瘤免疫治疗中的应用[D]. 陈仿军. 南京大学, 2017(05)
  • [6]多靶点抗原肽自体免疫细胞治疗原发性肝细胞癌的免疫应答研究及联合TACE的临床疗效[D]. 吴叶婷. 南方医科大学, 2017(01)
  • [7]rhAAV/AFP感染DC分泌的Exosome诱导抗肝癌特异性T细胞的免疫效应研究[D]. 李洁羽. 福建医科大学, 2016(07)
  • [8]多靶点抗原肽自体免疫细胞治疗原发性肝细胞癌的临床安全性及免疫应答研究[D]. 黄静. 南方医科大学, 2016(05)
  • [9]AFP基因修饰的DC细胞的分泌的exosome抗肿瘤作用研究[D]. 黄胜兰. 福建医科大学, 2014(02)
  • [10]MAGE-1短肽体外免疫效应的实验研究[D]. 金洪娟. 吉林大学, 2011(04)

标签:;  ;  ;  ;  ;  

MAGE-3抗原肽在体外诱导肝细胞癌患者的免疫反应
下载Doc文档

猜你喜欢