一、大鼠肾脏系膜细胞转染人TGF-β1基因可增强MMP-2表达（论文文献综述）
苏珊珊[1]（2021）在《基于miR-218/GPRC5A通路探讨补阳还五汤干预糖尿病肾损伤的机制研究》文中研究表明背景:糖尿病肾病（DN）是继发于糖尿病的重要微血管并发症,是终末期肾病的主要病因。现已证实高血糖环境可对所有类型的肾脏固有细胞产生深远影响,导致肾小球硬化及小管间质纤维化,最终导致不可逆转的肾功能衰竭。新近研究显示DN的肾小管病变可独立于肾小球病变发生,与肾功能恶化有更密切的相关性,在DN的进展中亦起到了关键作用。因此寻找以肾小管细胞为靶点的生物标志物可能有助于DN的研究及临床治疗。大量研究已证实miRNAs参与调节DN发病过程中的多个环节,同时高糖环境下的体内及体外实验也证实肾脏固有细胞可以诱导miRNA表达,因此识别潜在的特异性miRNAs生物标志物有助于早期预测或检测糖尿病的发展和进展及其并发症。补阳还五汤出自清代王清任《医林改错》,为益气活血的代表方剂,多用于气虚血瘀病证的治疗。大量研究显示:补阳还五汤可通过多种途径减轻糖尿病肾病的临床症状、改善肾脏固有细胞病理损伤,从而延缓肾功能下降。目的:1、通过体外实验探讨miR-218/GPRC5A通路在高糖诱导肾小管上皮细胞损伤中意义及可能的作用机制。2、采用db/db小鼠模型,验证经典名方补阳还五汤对db/db小鼠肾损伤的干预作用,探讨其对miR-218/GPRC5A通路的调控作用,进一步解释其分子生物学机制,为揭示糖尿病肾病的发病机制和未来的治疗策略提供新的思路。方法:1.miR-218/GPRC5A通路在高糖诱导HK-2细胞损伤中的作用机制1.1生信分析从GEO数据库下载数据,利用GEO在线分析工具GEO2R进行差异基因分析,确认miR-218进行研究。运用靶基因网站Target Scan和miRDB进行miR-218靶目标预测。1.2 miR-218/GPRC5A通路在高糖诱导肾小管上皮细胞损伤中的机制（1）细胞培养:人肾近端小管细胞（HK-2）购自ATCC。细胞在37°C添加10%胎牛血清的DEME培养基中培养,生长至60%,血清饥饿12h后分为高糖组、正常糖组及对照组。（2）细胞转染:miR-218 mimic/inhibitor及各自阴性对照、pc DNA3.1-GPRC5A和相应的对照载体由Lipofectamine 3000转染至细胞内。48h后用q RT-PCR检测转染效率。（3）q RT-PCR:Trizol提取全RNA,利用Prime Script RT Reagent Kit反转录成c DNA。利用SYBR Premix Ex Taq II在7500 real-time PCR system检测miRNA表达,GAPDH作为内参,2-ΔΔCt用于分析m RNA相对表达。（4）Western blot:用RIPA裂解液提取蛋白质,BCA法测定蛋白浓度,95°C加热5min。在垂直电泳槽中加入等量蛋白质,用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质样品。转膜至PVDF膜,加入5%脱脂奶粉封闭1h,一抗4℃孵育过夜,TBST洗3×5min,二抗室温孵育1 h,洗膜后加ECL显影。QUANTITY ONE软件扫描灰度值,以GAPDH为内参对照,目的蛋白/内参计算各蛋白的相对表达量。（5）CCK-8检测:将细胞悬液以每孔1000个细胞的标准种到96孔板中,常规培养,每隔24h检测一次细胞活力,测定450nm吸光度,用OD值绘制增殖曲线。（6）凋亡检测:收集细胞到离心管中,1000 rpm离心5min,加入4℃预冷的PBS重悬细胞,再次离心沉淀细胞,小心吸出上清。加入1X结合缓冲液重悬细胞,调节细胞密度为1-5×106/ml。取100 ul细胞悬液至于5ml流式管中,加入5 ul Annexin V/FITC混匀后于室温避光孵育5 min。加入10ul PI染液,并加400 ul PBS,后进行上机检测。Flowjo软件对流式结果进行分析处理。（7）荧光素酶报告检测:细胞接种至24孔板,生长至80%汇合度,将GPRC5A-WT和GPRC5A-Mut的3’-UTR克隆到pmiR-RB-REPORTTM双荧光素报告载体中,与miR-218mimic及Control共转染HK-2细胞,利用Dual-Luciferase Reporter Assay Kit检测荧光强度。2.补阳还五汤对调控miR-218/GPRC5A通路干预db/db小鼠肾损伤研究（1）实验小鼠:雄性4W龄自发性II型糖尿病db/db小鼠,随机分为模型组（DKD组）、补阳还五汤低剂量组（DKD+BYHWT-l组）、补阳还五汤高剂量组（DKD+BYHWT-h组）。雄性同遗传背景不发病db/m小鼠,随机分为对照组（Control）、对照组+补阳还五汤低剂量组（Control+BYHWT-l）、对照组+补阳还五汤高剂量组（Control+BYHWT-h）。（2）药物干预:DKD+BYHWT-l组、DKD+BYHWT-h组、Control+BYHWT-l、Control+BYHWT-h分别给予补阳还五汤2.7g/kg/d及5.4g/kg/d灌胃给药,对照组及模型组每日给予等容量生理盐水。（3）肾功能、血糖、尿蛋白排泄率检测:药物干预期间每隔4W测体重、血糖、尿蛋白排泄率（UAE）及血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）指标,喂养至16W后处死。（4）肾组织病理形态观察:取一侧肾组织于4%多聚甲醛中固定,分别进行PAS及Masson染色观察各组小鼠肾组织病理形态及结构改变。（5）另一侧的肾脏组织研磨后进行q RT-PCR检测miRNA表达,Western blot检测GRPC5A以及a-SMA、Vimentin、Col-1蛋白的表达。同时检测凋亡相关蛋白及炎症因子蛋白的表达。3.统计分析采用SPSS22.0和GRAPHPAD Prism 6.0。组间比较采用t检验,组间比较采用单因素方差分析和Tukey’s检验,结果用均数±标准差（SD）表示。P<0.05被认为有显着性差异。结果:1.miR-218/GPRC5A通路在高糖诱导肾小管上皮细胞损伤中的机制1.1从GEO数据库（访问号:GSE114477）下载数据,利用GEO2R进行差异基因分析,结合文献研究确认miR-218进行研究。同时运用靶基因网站进行miR218靶目标预测,结合数据库（访问号:GSE30528）中的差异性基因分析,最终确认GPRC5A作为miR-218的靶基因进行下一步分析。1.2 miR-218/GPRC5A通路在高糖诱导肾小管上皮细胞损伤中的机制（1）采用q RT-PCR方法检测miR-218和炎症因子在NC对照组、NG组和HG组的表达水平。结果显示:miR-218、炎性因子TNF-α和IL-1β在高糖条件下的表达水平明显升高（P<0.01）。（2）高糖条件下HK-2细胞miR-218、炎性因子TNF-α和IL-1β的蛋白表达水平明显高于NC对照组及NG组（P<0.01）。（3）转染miR-218模拟物、miR-218抑制剂或NC miRNA对高糖条件下细胞miR-218表达水平的影响实验显示:miR-218模拟物可上调miR-218的表达水平,而miR-218抑制剂可降低miR-218的表达水平（P<0.01）。采用CCK-8检测HK-2细胞活力,OD结果显示,HG组细胞活力在48h和72h明显低于对照组（P<0.01）。而经miR-218抑制剂转染,miR-218表达下调48h和72h细胞存活率明显高于HG组（P<0.01）。这些结果表明,miR-218的下调促进了高糖条件下肾近端小管细胞的活力。（4）Annexin v/FITC流式细胞术结果显示,与对照组相比,HG组细胞凋亡明显增加,而miR-218缺失后,HG组细胞凋亡率明显降低（P<0.01）。（5）Western blot检测显示:高糖作用下HK-2细胞中裂解蛋白caspase-3、裂解蛋白caspase-9的表达明显增强,经miR-218抑制剂处理后,其表达水平明显下调。与对照组相比,经miR-218抑制剂处理后,HK-2细胞中促凋亡蛋白（裂解caspase-3和裂解caspase-9）的表达明显降低。（6）GPRC5A-WT/Mut和miR-218 mimic/Control用Lipofectamine 3000共转染HK-2细胞,采用双荧光素酶报告实验验证,结果显示:miR-218表达增强后,WT GPRC5A 3?-UTR报告基因荧光素酶活性显着降低（P<0.0 1）。同时证实模拟miR-218可显着降低GPRC5A蛋白和miRNA的表达水平（P<0.01）。（7）miR-218抑制剂和pc DNA3.1-GPRC5A的共转染实验显示,GPRC5A过表达可增强miR-218抑制剂对高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤的减轻作用。miR-218抑制剂和pc DNA3.1-GPRC5A共转染HK-2细胞后,细胞存活率明显提高,同时凋亡和炎症因子水平明显降低（P<0.01）。2.补阳还五汤调控miR-218/GPRC5A通路改善db/db小鼠肾损伤研究（1）经补阳还五汤干预后,db/db小鼠的体重,空腹血糖、UAE、肾功能指标水平与模型组相比显着改善（p<0.01,p<0.05）。（2）补阳还五汤干预后db/db小鼠肾脏病理形态损伤程度均低于模型组。（3）补阳还五汤干预后db/db小鼠肾组织miR-218表达显着下降,GPRC5A蛋白水平显着提高（P<0.01）。（4）补阳还五汤干预可显着降低db/db小鼠肾纤维化标志性蛋白a-SMA、Vimentin及Col-1表达水平（P<0.01）,抑制肾组织凋亡蛋白裂解caspase-3、裂解caspase-9蛋白及炎症因子TNF-α、1L-1β蛋白的表达（P<0.01,p<0.05）。结论:1.高糖诱导的HK-2细胞miR-218、炎症因子TNF-α和IL-1β表达水平显着升高。2.抑制miR-218的表达可促进高糖条件下肾近端小管细胞的活力,减少高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡。3.miR-218可直接靶向GPRC5A,并负向调控GPRC5A的表达。4.miR-218/GPRC5A通路可调节高糖诱导的肾小管细胞增殖和凋亡,作为治疗糖尿病肾病的潜在有效靶点。5.补阳还五汤可改善db/db小鼠血糖及体重增加过快,减少尿蛋白排泄率,降低血肌酐及血尿素氮,改善肾功能。6.补阳还五汤可减轻DN肾组织病理损伤,抑制肾纤维化相关蛋白的表达,减轻肾组织凋亡蛋白及炎症因子蛋白的表达,延缓肾小球硬化和肾小管间质纤维化。7.补阳还五汤可通过调控miR-218/GPRC5A通路而发挥对DN肾损伤的保护作用,为DN的防治提供了新的可能途径。
韩聪[2]（2021）在《芪黄四物汤通过调控miRNA-mRNA共表达网络改善肾脏纤维化的机制研究》文中研究指明目的:本研究围绕慢性肾脏病（CKD）与肾脏纤维化（RF）开展临床与实验研究。首先通过前瞻性的临床随机对照试验初步探讨芪黄四物汤改善CKD与RF的有效性与安全性。在此基础上分别在体内、体外以环孢素A（CsA）诱导小鼠及人肾小管上皮细胞（HKC）RF模型,先进行体内研究观察芪黄四物汤通过调控miRNA-mRNA共表达网络对RF小鼠肾脏结构与功能的保护作用,再行体外研究观察芪黄四物汤通过调控共表达网络中的代表性miRNA-mRNA抑制HKC上皮间质转分化（EMT）进而改善RF的作用。通过临床与实验研究为芪黄四物汤防治CKD及RF提供理论依据及实验支撑。方法:1.芪黄四物汤治疗CKD3-5期患者有效性与安全性的研究:根据计算的样本量及入选标准共纳入80例CKD3-5期的患者,试验组与对照组各40例。对照组给以西医常规对症治疗,试验组在对照组的基础上加用芪黄四物汤,治疗周期为8周。运用SPSS19.0进行统计分析,于治疗4周、8周时观察血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、尿酸（UA）、估算的肾小球滤过率（e GFR）、尿α1-微球蛋白（α1-MG）、尿NAG酶、尿蛋白/肌酐比值（UACR）的变化,于治疗8周时观察血红蛋白（HGB）、血钙、血磷、甲状旁腺激素（PTH）、转化生长因子β1（TGF-β1）、白细胞介素-6（IL-6）、超氧化物歧化酶（SOD）及中医证候积分的变化,并比较2组的中医证候有效率及临床总有效率。2.芪黄四物汤对CsA诱导的RF小鼠肾脏保护作用的研究:以CsA诱导建立小鼠RF模型（分为正常组,模型组,芪黄四物汤低、中、高剂量组及缬沙坦对照组）。观察芪黄四物汤干预后RF小鼠体质量、24h尿量等一般情况。通过肾脏HE、PAS、Masson染色观察肾脏病理变化,通过TUNEL法观察肾组织凋亡情况,通过生化分析或ELISA法检测肾功能与RF相关指标:Scr、BUN、UA、UACR、NAG、MDA、IL-6的变化。3.芪黄四物汤对RF小鼠miRNA-mRNA共表达网络的调控作用:本研究进一步对上述实验的小鼠（正常组、模型组、芪黄四物汤高剂量组）肾脏进行miRNA与mRNA联合测序。首先筛选芪黄四物汤改善RF的靶差异（DE）miRNAs并进行验证,同时通过生信分析（Target Scan等软件）预测DE miRNAs的靶DE mRNAs并通过Cytoscape构建DE miRNAs与其靶DE mRNAs的2个共表达网络（正常组vs模型组;芪黄四物汤高剂量组vs模型组）。进一步通过kegg富集出2个共表达网络中靶DE mRNAs的Top20通路,筛选出共同的通路即芪黄四物汤改善RF的靶通路,再进一步筛选出靶通路中的靶DE mRNAs,并通过qRT-PCR、Western Blot、免疫荧光及ELISA法对其中的RF相关靶DE mRNAs在基因与蛋白水平进行验证,同时为后续细胞实验选取代表性的miRNA-mRNA进一步进行研究。4.芪黄四物汤通过调控miR-21-5p/SMAD7轴对CsA诱导的HKC EMT的影响:以CsA干预HKC建立RF模型,分别采用MTT法、Transwel实验及流式法观察芪黄四物汤对HKC增殖、凋亡、迁移的影响。采用qRT-PCR及Western Blot法观察芪黄四物汤对EMT相关表型E-cadherin与a-SMA的影响,并观察其对动物实验筛选的部分靶miRNAs（miR-21-5p、miR-375-3p及miR-802）、部分靶mRNAs（SMAD7、TGFβ1）及SMAD3的影响。通过Target Scan预测到miR-21-5p与SMAD7是靶向调控对,进一步模拟或抑制miR-21-5p观察SMAD7、E-cadherin、a-SMA的表达及HKC迁移能力的变化。结果:1.芪黄四物汤治疗CKD3-5期患者安全有效:（1）临床总疗效:治疗后对照组的临床总有效率为62.16%,试验组的临床总有效率为78.38%,试验组治疗效果优于与对照组（P<0.05）。（2）中医证候积分及疗效:治疗后2组的中医证候积分均极显着下降（P<0.01）,对照组的中医证候总有效率为43.24%,试验组的中医证候总有效率为67.57%,试验组在改善中医证候积分（P<0.01）及中医证候总有效率（P<0.05）方面优于对照组。（3）肾功能相关指标:治疗后对照组有效改善了BUN、UA（P<0.05）,NAG（P<0.01）,Scr、e GFR、a1-MG、UACR与治疗前比无明显差异;试验组有效改善了BUN、UACR（P<0.01）,NAG、UA、Scr及e GFR（P<0.05）,a1-MG与治疗前比无明显差异;试验组在降低BUN及UACR方面优于对照组（P<0.05）。（4）CKD并发症指标:治疗后对照组有效改善了HGB、PTH（P<0.01）,血磷（P<0.05）,试验组有效改善了HGB、PTH及血磷（P<0.01）,2组血钙与治疗前比均无明显差异,试验组在升高HGB方面优于对照组（P<0.05）。（5）纤维化、氧化应激及炎症指标:治疗后对照组有效改善了TGF-β1（P<0.05）与IL-6（P<0.01）,SOD与治疗前无明显差异;试验组有效改善了TGF-β1、SOD（P<0.01）及IL-6（P<0.05）,试验组在降低TGF-β1方面优于对照组（P<0.05）。（6）治疗前后2组的肝功能均在正常范围且无明显差异（P>0.05）,2组均未有不良事件发生,试验过程安全有效。2.芪黄四物汤可调控miRNA-mRNA共表达网络改善小鼠RF:（1）芪黄四物汤各剂量组与模型组比较体质量及24小时尿量明显增加（P<0.01）,亦改善了Scr（P<0.05）、BUN（P<0.01）、UACR（P<0.01）、NAG（P<0.01或P<0.05）、MDA（P<0.01）,高剂量组相较于模型组改善了UA与及IL-6（P<0.05）。（2）芪黄四物汤各剂量组与模型组比较基底膜增厚、肾小管扩张、胞质空泡化、小动脉玻璃样变、间质纤维化等程度均减轻,极显着的改善了胶原容积分数（P<0.01）与肾组织细胞凋亡（P<0.01）。（3）miRNA测序结果显示模型组与正常组、芪黄四物汤高剂量组比较分别有55个、42个DE miRNAs（FC>1.5 or<0.67,P<0.05）,最终筛选出了芪黄四物汤改善RF的14个靶miRNAs,包括保护性的miRNAs（模型组下调,芪黄四物汤回调）:miR-677-3p、miR-138-2-3p、miR-3087-3p、miR-874-5p、miR-2137、miR-551b-3p、miR-187-3p,及损害性的miRNAs（模型组上调,芪黄四物汤回调）:miR-692、miR-137-3p、miR-21a-5p、miR-375-3p、miR-802-3p、miR-802-5p、miR-7b-5p,qRT-PCR的验证亦与测序结果高度一致。（4）mRNA的测序结果显示模型组与正常组比较有2463个DE mRNAs（FC>1.5 or<0.67,P<0.05）,其中1324（54%）个被55个DE miRNAs预测到,模型组与芪黄四物汤高剂量组比较有1898个DE mRNAs（FC>1.5 or<0.67,P<0.05）,其中679（36%）个被42个DE miRNAs预测到,我们构建了2个共表达网络并经KEGG富集靶DE mRNAs后筛选出了11条芪黄四物汤改善RF的靶通路:ECM受体相互作用、鞘脂代谢、白细胞跨内皮迁移、TGF-β信号通路、PPAR信号通路、不饱和脂肪酸的生物合成、内质网中的蛋白质加工、过氧化物酶体、色氨酸代谢、丁酸代谢及丙酸代谢。（5）在芪黄四物汤改善RF的11条靶通路中,共有37个靶DE mRNAs,它们在模型组的表达紊乱,又被芪黄四物汤回调,其中14个与RF（EMT及ECM沉积、TGF-β信号调控、内质网应激、脂肪酸代谢、线粒体氧化应激）密切相关。我们在基因和（或）蛋白水平对14个靶DE mRNAs进行了验证,与模型组比较,芪黄四物汤剂量依赖性或呈最佳浓度的降低了COL1A1、COL3A1、FN1、CD44、SPP1、MMP2、TGF-β1、PDIA6及DDIT3的基因与蛋白表达（P<0.01或P<0.05）,升高了SMAD7、PCK1、ACOX1、MPV17L与AGPS的基因和（或）蛋白表达（P<0.01或P<0.05）。此外,芪黄四物汤还升高了SOD的蛋白表达（P<0.01）,降低了8-OHd G的蛋白表达（P<0.01）。3.芪黄四物汤可通过miR-21-5p/SMAD7轴调控HKC EMT进而改善RF:（1）CsA剂量依赖性的抑制HKC增殖,在半数抑制（10mg/L,后续实验的浓度）的基础上芪黄四物汤15mg/m L（后续实验的浓度）促进HKC增殖最显着（P<0.01）。（2）CsA诱导下HKC的凋亡增加及迁移增强,芪黄四物汤减少了HKC的凋亡（P<0.01）,并抑制了HKC的迁移能力（P<0.01）。（3）与CsA诱导的模型组比较,芪黄四物汤升高了E-cadherin的基因（P<0.01）与蛋白（P<0.05）表达,降低了a-SMA的基因（P<0.05）与蛋白（P<0.01）表达。（4）与动物实验测序结果相一致,芪黄四物汤极显着的降低了CsA诱导的HKC miR-21-5p、miR-375-3p及miR-802的表达升高（P<0.01）,促进了SMAD7的基因与蛋白表达（P<0.01）,抑制了TGF-β1的基因（P<0.05）与蛋白（P<0.01）表达,同时抑制了SMAD3的基因（P<0.01）与蛋白（P<0.05）表达。（5）经Target Scan等生信软件预测到SMAD7是miR-21-5p潜在的靶基因,对HKC转染miR-21-5p模拟剂、抑制剂及相应阴性对照后,miR-21-5p mimics的表达提升20倍（P<0.01）而miR-21-5p inhibitor的表达下降5倍（P<0.01）,提示转染成功。（6）转染成功后用CsA造模并芪黄四物汤干预发现,与miRNA-NC mimics组相比,miR-21-5p mimics抑制了SMAD7的蛋白（P<0.01）与基因（P<0.05）表达,并降低了E-cadherin的蛋白表达（P<0.01）,升高了a-SMA的蛋白表达（P<0.01）,亦促进了HKC的迁移能力（P<0.01）;与miRNA-NC inhibitor组相比,miR-21-5p inhibitor促进了SMAD7的基因与蛋白表达（P<0.05）,并升高了E-cadherin的蛋白表达（P<0.01）、抑制了a-SMA的蛋白表达（P<0.01）,亦抑制了HKC的迁移能力（P<0.01）。结论:1.临床研究表明芪黄四物汤能有效改善慢性肾脏病3-5期患者的临床症状,保护肾功能,降低尿蛋白,缓解贫血及钙磷代谢紊乱等并发症,降低纤维化、氧化应激及微炎症状态,且安全有效,值得临床推广应用。2.进一步的体内研究发现,在CsA诱导的肾脏纤维化小鼠模型中,芪黄四物汤能调控紊乱的miRNA-mRNA共表达网络,通过改善共表达网络中与EMT及ECM受体相互作用、TGF-β信号调控、内质网应激、脂肪酸代谢及氧化应激相关的靶miRNAs与靶mRNAs,多靶点改善肾脏病理损伤、凋亡及ECM沉积,降低微炎症与氧化应激状态,保护肾功能,改善肾脏纤维化。3.再进一步的体外研究表明,在CsA诱导的HKC损伤模型中,芪黄四物汤可通过促进HKC增殖,抑制其凋亡及迁移,改善EMT相关表型基因的表达抑制EMT。其中在miRNA-mRNA共表达网络中,芪黄四物汤通过升高miR-21-5p进而降低其靶基因SMAD7的表达可能是其抑制EMT进而改善肾脏纤维化的重要机制。
聂萍[3]（2021）在《间充质干细胞对2型糖尿病肾脏保护作用及机制研究》文中研究说明糖尿病肾病是糖尿病最常见的并发症之一。其主要组织学特点为肾小球肥大、肾小球和肾小管基底膜增厚、肾小球系膜基质增多。糖尿病时高糖血症,诱导高脂血症,二者共同作用加重了肾脏组织的氧化损伤,进一步导致细胞凋亡及纤维化,进而发展为终末期肾病。肾小球系膜细胞是肾小球内的固有细胞,在糖尿病肾病的发生发展中起关键作用。高糖可以引起肾小球系膜细胞的过度增殖,产生活性氧并在肾实质细胞中积聚,导致细胞凋亡、基质重塑、组织纤维化,最终导致肾小球硬化。间充质干细胞是一类具有多向分化潜能的成体干细胞,有自我更新,低免疫原性,组织修复等特性,可能是治疗糖尿病肾病的一种新方法,其具体机制尚不明确。人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells,h UCMSCs）取材于人脐带组织,具有取材方便,易于分离,纯度高,体外增殖分化能力强,无伦理学争议等优点,比其他来源的干细胞更有应用前景。因此,本研究探讨h UCMSCs对2型糖尿病的肾脏保护作用及机制。研究指出,间充质干细胞可以通过调节核因子网织红细胞2相关因子2（Nuclear factor erythroid2-related factor2,Nrf2）减轻细胞凋亡,从而减轻肺损伤、脊髓损伤及肝脏损伤。Nrf2是调节氧化损伤的重要转录因子,亦参与抗细胞凋亡。间充质干细胞是否通过调节Nrf2改善糖尿病时肾脏氧化损伤,进一步起到抗凋亡及纤维化的作用值得我们深入探讨,因此我们进行了以下实验。第一部分,通过体内及体外实验,证明h UCMSCs对2型糖尿病有肾脏保护作用。体内实验,选用体重180-200g的斯普拉格-道利大鼠,高脂饮食喂养,6周后一次性腹腔注射35mg/kg剂量的链脲佐菌素,建立2型糖尿病模型。监测血糖、尿量及尿蛋白,STZ注射8周后,糖尿病大鼠尿量明显增多,出现尿蛋白,开始尾静脉注射h UCMSCs,每次2*106个/只,间隔10天,共注射3次。末次注射h UCMSCs 10天后处死大鼠。通过western blot、RT-q PCR、免疫组化、TUNEL染色等方法检测肾脏氧化损伤,炎症反应,凋亡,以及纤维化指标,观察h UCMSCs对糖尿病大鼠的肾脏保护作用。体外实验,以高糖高脂刺激的肾小球系膜细胞作为模拟2型糖尿病的细胞模型,并应用transwell小室构建肾小球系膜细胞和h UCMSCs共培养体系,观察h UCMSCs对高糖高脂刺激的肾小球系膜细胞的保护作用。第二部分,探讨h UCMSCs对2型糖尿病的肾脏保护作用的具体机制。首先应用western blot、RT-q PCR等方法检测Nrf2及Nrf2下游因子的表达水平,探讨h UCMSCs是否影响Nrf2及下游因子的表达;其次,分离大鼠肾组织核蛋白,通过western blot检测细胞核及细胞浆蛋白中Nrf2的含量,进一步探讨h UCMSCs对Nrf2的调节的方式是仅通过增加其表达,还是通过促进核转位;并应用细胞免疫荧光染色检测肾小球系膜细胞Nrf2的位置及表达水平;之后,给予肾小球系膜细胞Nrf2 si RNA干扰,观察特异性抑制Nrf2表达之后,h UCMSCs对系膜细胞的保护作用是否减弱,证实Nrf2是h UCMSCs治疗糖尿病肾病中的关键因子。最后,通过western blot检测PI3K/AKT/m TOR信号通路蛋白的磷酸化水平,探讨h UCMSCs是否通过激活Nrf2上游的PI3K/AKT/m TOR信号通路保护糖尿病肾病。本实验的研究结果如下:1.HUCMSCs降低2型糖尿病大鼠血糖,尿蛋白及肾脏肥大指数体内实验,我们检测了实验结束时各组大鼠的生化指标,发现给予h UCMSCs治疗的糖尿病大鼠血糖,尿微量白蛋白/尿肌酐,肾脏肥大指数明显低于糖尿病组大鼠（P<0.05）。2.HUCMSCs改善2型糖尿病大鼠肾脏组织学病变通过肾组织病理染色发现,糖尿病组大鼠肾小球面积增大,系膜基质增多,肾小球基底膜增厚,足细胞足突融合,肾小球及小管间质出现纤维化,给予h UCMSCs治疗后,上述病变明显减轻。3.HUCMSCs减轻2型糖尿病大鼠肾脏氧化损伤、炎症、凋亡及纤维化糖尿病大鼠肾组织氧化损伤指标丙二醛水平,4-HNE,炎症指标PAI-1,ICAM-1,TNF-α,凋亡指标caspase-3,纤维化指标TGF-β,CTGF和CollagenⅣ的表达水平与对照组大鼠相比,明显增加（P<0.05）,h UCMSCs治疗后,糖尿病大鼠丙二醛水平及上述蛋白表达明显降低（P<0.05）;此外,TUNEL染色证实,h UCMSCs治疗的糖尿病大鼠肾脏细胞凋亡水平明显低于糖尿病组。4.HUCMSCs对高糖高脂干预的肾小球系膜细胞有保护作用体外实验证实,与对照组相比,高糖高脂处理的肾小球系膜细胞氧化损伤指标4-HNE,凋亡相关蛋白caspase-3的表达水平明显增加,Bcl2/Bax明显降低（P<0.05）;给予h UCMSCs共培养可显着降低系膜细胞4-HNE,caspase-3的表达水平,并上调Bcl2/Bax（P<0.05）。5.HUCMSCs促进Nrf2及其下游因子的表达体内实验,通过免疫组化染色证实h UCMSCs治疗的糖尿病大鼠肾组织中Nrf2表达明显高于糖尿病大鼠;h UCMSCs治疗的糖尿病大鼠Nrf2及下游因子SOD2,NQO-1,HO1的表达明显高于糖尿病组（P<0.05）。体外实验,高糖高脂刺激的肾小球系膜细胞中Nrf2及SOD2,NQO-1,HO1的表达低于对照组（P<0.05）,h UCMSCs共培养后,Nrf2及下游因子表达明显高于高糖高脂刺激组（P<0.05）。6.HUCMSCs不仅增加Nrf2表达,而且促进Nrf2核转位体内实验证实,与对照组和糖尿病组相比,h UCMSCs治疗的糖尿病大鼠肾组织细胞核Nrf2的表达均增加（P<0.05）,而细胞浆中Nrf2表达无统计学差异,说明在糖尿病时,h UCMSCs不仅能增加Nrf2表达,而且能够促进Nrf2核转位。体外实验,用细胞免疫荧光方法非定量观察Nrf2表达位置及表达水平,结果发现,对照组及高糖高脂组,Nrf2主要在聚集在细胞质中,给予h UCMSCs共培养后,肾小球系膜细胞Nrf2的荧光强度明显增加,且核内聚集明显增多。7.Nrf2在h UCMSCs保护糖尿病肾病的过程中起关键作用通过体外实验,给予Nrf2 si RNA干扰后,高糖高脂刺激的肾小球系膜细胞4-HNE,Bax蛋白表达明显高于对照组（P<0.05）,而给予h UCMSCs共培养不能减低上述蛋白的表达水平（P>0.05）。8.HUCMSCs激活Nrf2上游信号通路PI3K/AKT/m TOR体内实验证实,糖尿病大鼠AKT,m TOR的磷酸化水平明显低于对照组（P<0.05）,h UCMSCs治疗可以上调AKT,m TOR的磷酸化水平（P<0.05）。体外实验证实,h UCMSCs共培养后的系膜细胞PI3K,AKT的磷酸化水平明显高于高糖高脂刺激组,说明PI3K/AKT/m TOR信号传导途径参与了h UCMSCs激活Nrf2治疗糖尿病肾病的过程。综上,我们得出结论,人脐带间充质干细胞能够改善2型糖尿病时肾脏的氧化损伤,炎症、凋亡及纤维化;Nrf2激活是人脐带间充质干细胞保护糖尿病肾脏损伤的重要机制之一。
张杰[4]（2021）在《E3泛素连接酶TRIM31在高血压肾病中的作用及机制研究》文中认为研究背景高血压作为心脑血管疾病发生的主要致病因素,同时也是导致肾脏发生损伤的重要原因。高血压肾病（Hypertensive Renal Disease,HRD）是由原发性高血压导致的肾脏结构和功能的损害,是内科常见疾病之一,但其发病机制尚未完全清楚。高血压肾损害主要表现为蛋白尿增多、良性肾小球硬化、肾脏间质纤维化以及炎症细胞浸润。肾小管及间质的纤维化、炎症和免疫激活是导致HRD持续进展的重要因素。细胞外基质蛋白合成及其降解之间的平衡受损造成过量的基质沉积,这是纤维化过程的一个典型特征。炎症因子的分泌以及炎症细胞的浸润是肾脏纤维化的始动因素。目前还没有有效的方法可预防纤维化的进展,因此提高对HRD纤维化和炎症进展的细胞及分子机制的认识至关重要。目前研究中常见的HRD发病机制有遗传因素、盐敏感、氧化应激、内皮细胞功能障碍以及肾素-血管紧张素醛固酮系统（Renin-Angiotensin-Aldosterone System,RAAS）的激活。抑制RAAS的过度激活是目前减缓肾脏疾病进展的最有效的方法。血管紧张素Ⅱ（Angiotension Ⅱ,AngⅡ）作为RAAS的主要效应因子,主要通过血流动力学和非血流动力学两方面参与血压和靶器官损害的调节。它可作用于肾脏血管平滑肌细胞,导致血管收缩;它也可作为促炎剂,激活细胞内信号传导系统,促进肾脏的炎症反应;而且它可通过上调转化生长因子β1（Transforming growth factor-beta 1,TGF-β1）的表达、增加成纤维细胞增殖,促进细胞外基质的合成、抑制细胞外基质的降解,加速肾脏纤维化的过程。因此,AngⅡ是HRD进展中的关键调节因子。泛素化修饰作为一种常见的蛋白质翻译后修饰,不仅是蛋白酶体降解目的蛋白的标记,也是蛋白-蛋白相互作用和酶激活的调节因素。目前研究发现多种E3泛素连接酶可调控高血压及其靶器官的损害,但针对高血压肾损伤的泛素化修饰研究还鲜有报道。发现调控HRD的新型E3泛素连接酶及探寻其调控机制,将为阐述HRD发病机制及研发HRD药物提供良好的理论基础,这也成为当前该领域的热点问题。TRIM（The tripartite motif）31属于TRIM家族的一员,也是一个非常重要的E3泛素连接酶,其是否同样在高血压及HRD中发挥重要作用尚未报道。既往研究表明,TRIM31在多种疾病发展中发挥着关键的调控作用,尤其是在肿瘤的增殖、迁移过程中,机制方面主要涉及到TRIM31调控核因子κB（Nuclear factor kappa-B,NF-κB）的活化参与炎症反应。因NF-κB的活化在HRD的病理进展中发挥着至关重要的作用,提示TRIM31可能同样参与到HRD疾病的发生和发展中。在本实验中,我们提出以下科学假设:在AngⅡ构建的HRD小鼠模型中,E3泛素化连接酶TRIM31可改善肾脏功能、纤维化和炎症反应。为了验证以上假说,我们精心设计了一系列的体内和体外实验。研究目的1.探讨TRIM31与人和小鼠HRD病理进展的相关性;2.探讨TRIM31是否参与调节HRD小鼠的肾脏功能损害;3.探讨TRIM31是否参与调节HRD小鼠的肾脏纤维化;4.探讨TRIM31是否参与调节HRD小鼠的肾脏炎症反应。研究方法1.实验动物利用 TALEN（Transcription activator-like effectors Nucleases）技术构建TRIM31基因敲除（TRIM3 1-/-）小鼠,小鼠背景为C57BL/6J。与野生型C57BL/6J小鼠杂交扩繁,得到同窝纯合野生型C57BL/6J（TRIM31+/+）小鼠和TRIM31-/-小鼠。野生型C57BL/6J小鼠购买于维通利华（北京）实验动物技术有限公司。所有动物实验均遵循国家卫生部动物管理办法（documentation No 55,2001）,同时遵守山东大学齐鲁医院伦理委员会对动物实验的要求和规定。2.实验动物分组（1）选取8周龄雄性野生型（Wildtype,WT）C57BL/6J小鼠,随机分成两组,每组15只:生理盐水组,AngⅡ组。（2）分别选取8周龄雄性TRIM31-/-小鼠和同窝雄性TRIM31+/+小鼠,随机分为四组,每组15只:TRIM31+/++生理盐水组,TRIM31-/-+生理盐水组,TRIM31+/++AngⅡ 组,TRIM31-/-+AngⅡ 组。3.HRD小鼠模型的建立预先将微量渗透泵灌注适当剂量AngⅡ分别埋入8周龄雄性小鼠的背侧皮下,以泵速1000ng/kg/min持续泵入AngⅡ 42天,构建高血压小鼠模型,对照组泵入同等体积的无菌生理盐水（每组15只）。分别于造模前和造模后每周定时测量小鼠血压、体重,并留取小鼠24h尿液。实验结束时,将小鼠进行安乐死,测量体重及左右肾重,并留取小鼠血液、肾脏、心脏、肝脏、小肠等组织标本进行下一步组织和细胞分子学研究。4.临床高血压肾病患者肾活检标本收集和检测我们从山东大学病理学教研室获得行肿瘤切除术的无高血压患者的正常癌旁肾组织（Control）、无高血压的肾小球轻微病变（Glomerular minor lesion,GML）患者肾脏活检组织、HRD患者肾脏活检组织样本。利用免疫组化（immunohistochemistry,IHC）检测TRIM31蛋白的表达情况,同时利用苏木素-伊红染色（Hematoxylin andeosin,HE）和 Masson’s trichrome 染色探讨 TRIM31蛋白表达与肾脏损伤和纤维化程度的相关性。5.小鼠基因型鉴定利用鼠尾提取试剂盒提取小鼠鼠尾DNA,PCR扩增后通过测序对小鼠进行基因型鉴定。同时提取小鼠的肾脏组织蛋白,通过蛋白免疫印迹分析（Western blot）的方法检测TRIM31的蛋白表达水平,评估TRIM31的基因敲除效率。6.细胞培养和处理实验中采用人近端肾小管上皮细胞系（Human proximal renal tubular eβ1thelial cell-2,HK2）,培养在 10%FBS 的 RPMI1640 培养基中,于含 5%CO2 的 37℃孵箱中增殖。主要处理见下:（1）时间浓度实验:选用10-5MAngⅡ分别刺激HK2细胞0,4h,8h,12h,24h,36h,收集细胞。（2）浓度梯度实验:分别选用 0,10-8M,10-7M,10-6M,10-5M,10-4M的 AngⅡ刺激HK2细胞24h,收集细胞。7.小鼠血压测量利用Data Sciences International（DSI）无线遥感测量方法分别于造模前和造模后每周定时测量4组小鼠（TRIM31+/++生理盐水组,TRIM31-/-+生理盐水组,TRIM31+/++AngⅡ 组,TRIM31-/-+AngⅡ 组）的收缩压（Systolic blood pressure,SBP）和舒张压（Diastolic blood pressure,DBP）。8.小鼠组织样本取材分别于造模前和造模后每周定时测量小鼠血压、体重,并留取小鼠尿液进行相关肾脏功能指标检测。实验结束时,将小鼠进行安乐死,并留取小鼠血液、肾脏、心脏、肝脏、小肠等组织标本,对心脏和左右肾脏进行称重,剥除肾脏包膜,依后期实验需求将各个组织放于液氮保存或者放于4%多聚甲醛中固定24-48h或者放于2%戊二醛中固定以待后续实验使用。9.小鼠肾脏功能和24h尿蛋白检测留取小鼠血液和尿液,利用全自动生化仪和ELISA的方法检测TRIM31-/-小鼠与 TRIM31+/+小鼠血清中尿素氮（Blood urea nitrogen,BUN）、肌酐（serum creatinine,Cr）、尿酸（Uric acid,UA）以及24h尿蛋白等主要肾脏功能指标的差异。10.透射电镜（Transmission electron microscope,TEM）观察小鼠肾脏超微结构取4组小鼠的肾脏皮质,利用2.5%的戊二醛固定组织后,利用透射电镜观察4组小鼠的肾小球足突细胞、基底膜等超微结构。11.Meso Scale Discovery（MSD）检测血清中炎症相关指标取的4组小鼠冻存在-80℃冰箱的血清,基于电化学发光的原理,利用预包埋好的MSD多因子检测板和MSD检测器来检测小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β和MCP-1的含量。12.小鼠肾脏组织学和IHC染色将固定在4%多聚甲醛中的4组小鼠肾脏组织脱水包埋成蜡块,制备石蜡切片（厚度:4μm）。通过Masson’s trichrome和天狼猩红染色检测4组小鼠肾脏间质的纤维化情况。过碘酸雪夫氏染色（Periodic acid-schiffstain,PAS）观察小鼠肾脏中肾小球硬化的差异。利用IHC的方法检测4组小鼠肾脏组织中TRIM31、KIM-1、Nephrin、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、Collagen Ⅳ、Fibronectin、α-SMA、CD68、TNF-α、IL-6和IL-1β的表达差异。13.组织RNA提取、反转录和实时荧光定量PCR（Real-time PCR,RT-PCR）提取4组小鼠肾脏组织和HK2细胞的RNA,利用TAKARA反转录试剂盒进行mRNA的反转录,然后通过RT-PCR获得目的基因trim31、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ、collagen Ⅳ、fibronectin、α-sma、tnf-α、il-6和il-1β的 Ct 值,利用β-actin作为内参,将所得的Ct值,采用公式（2-ΔΔCT）计算目的分子表达量的的相对变化。14.Western blot 分析利用蛋白提取试剂盒提取4组小鼠肾脏组织蛋白,或利用细胞裂解液提取HK2细胞蛋白,BCA调定蛋白浓度后进行SDS-PAGE凝胶电泳,检测TRIM31、TRIM31、KIM-1、Nephrin、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、Collagen Ⅳ、Fibronectin、Δ-SMA、TNF-Δ、IL-6 和 IL-1β 的蛋白含量。15.数据统计分析方法所有数据分析均使用的GraphPad Prism 8软件,以均数（mean）±标准误（SEM）进行表示。首先采用Shaβ1ro-Wilk检验对数据分布进行正态性假设的评估。对于属于正态分布的单因素数据,两组间的统计差异采用非配对t检验分析,多组间的统计差异采用单因素方差分析。对于具有两个变量的多组数据,验证数据属于正态分布后,使用双因素方差分析进行分析其统计差异。对于不属于正态分布的数据,我们使用的Kruskal-Wallis检验进行非参数统计分析。在所有的统计比较中,p值小于0.05为有统计学意义。研究结果1.在AngⅡ诱导的HRD小鼠模型肾组织中TRIM31的表达量明显下调我们通过在小鼠皮下埋入AngⅡ缓释泵成功构建了 HRD小鼠模型。通过IHC、Western blot和RT-PCR的方法进行检测,发现与生理盐水组对比,AngⅡ组小鼠肾脏的TRIM31表达量明显下调。2.AngⅡ剂量和时间依赖性调控肾小管上皮细胞中TRIM31的表达体外培养的HK2细胞,AngⅡ刺激细胞不同的时间（0,4h,8h,12h,24h,36h）或以不同的浓度（0,10-8 M,10-7M,10-6 M,10-5 M,10-4 M）的 AngⅡ刺激细胞,利用Western blot和RT-PCR的方法进行检测,发现伴随AngⅡ的梯度刺激,TRIM31的表达在蛋白水平和mRNA水平均呈现显着降低。以上体内外实验说明,TRIM31的表达与HRD存在一定相关性,提示我们TRIM31可能参与到HRD疾病进展过程。3.利用TRIM31敲基因小鼠构建AngⅡ诱导的小鼠HRD模型（1）在C57BL/6J的小鼠背景下,利用TALEN技术成功构建TRIM31敲基因小鼠。提取小鼠鼠尾基因组DNA进行鼠尾基因型鉴定,证实了 TRIM31敲基因小鼠成功构建。同时提取TRIM3 1+/+和TRIM3 1-/-小鼠肾脏组织蛋白,利用Western blot的技术进一步验证了 TRIM31敲基因小鼠中TRIM31的蛋白敲除效率。（2）测量4组小鼠（TRIM31+/++生理盐水组,TRIM3 1-/-+生理盐水组,TRIM31+/++AngⅡ组,TRIM3 1-/-+AngⅡ组）造模前后的体重和取材后左右肾重量,发现TRIM31基因敲除并不影响小鼠的肾重/体重比。4.TRIM31基因缺失不影响AngⅡ诱导的小鼠血压的改变利用DSI遥感法对4组小鼠的SBP及DBP进行测量,结果显示,与生理盐水组对比,AngⅡ组小鼠血压在泵入后第一周起即出现明显升高,并在接下来的几周持续在较高水平。DSI测量结果显示AngⅡ组小鼠造模结束前最后一周血压均大于140mmHg,达到高血压的水平,证实了小鼠高血压模型构建成功。然而在泵入生理盐水或者AngⅡ后,TRIM31+/+与TRIM31-/-两组小鼠间无明显血压改变。以上结果说明,TRIM31基因缺失不影响小鼠血压的基线水平,也不影响影响AngⅡ诱导的小鼠血压的改变。5.TRIM31基因缺失加重AngⅡ诱导的高血压肾功能损伤小鼠血清Cr、BUN和24h尿蛋白的测量表明,AngⅡ诱导的HRD小鼠出现了肾功能的损伤和小鼠肾滤过屏障的损害,而TRIM31基因缺失进一步加重了AngⅡ诱导的HRD小鼠的肾损伤。肾脏Nephrin、KIM-1的Western blot和IHC染色提示,TRIM31基因敲除加重了 AngⅡ引起HRD小鼠的肾小管的损伤和肾脏足突细胞的损害。同时PAS染色表明,AngⅡ诱导的HRD小鼠的发生了肾小球硬化,TRIM31基因敲除进一步加重HRD小鼠的肾小球硬化。此外,TEM检测发现TRIM31基因敲除后明显加AngⅡ诱导的HRD小鼠肾脏的足突和基底膜的损害。以上说明TRIM31基因缺失明显加重了 HRD小鼠的肾功能损伤。6.TRIM31基因缺失加重AngⅡ诱导的高血压肾纤维化Masson’s trichrome和天狼猩红染色显示,AngⅡ诱导的HRD小鼠的肾脏呈现明显的纤维化,并且TRIM31-/-小鼠较TRIM31+/+小鼠更严重。Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、Collagen Ⅳ、纤连蛋白（Fibronectin）和促纤维化因子 α-smooth muscle actin（α-SMA）的 IHC、Western blot、RT-PCR 实验显示在泵入 AngⅡ后,与TRIM31+/+对比,TRIM3 1-/小鼠的以上纤维化指标表达明显增加。提示TRIM31基因缺失可明显加重AngⅡ诱导的高血压肾纤维化。7.TRIM31基因缺失加重AngⅡ诱导的HRD小鼠肾脏的炎症反应利用MSD多因子检测技术检测4组小鼠（TRIM31+/++生理盐水组,TRIM31-/-+生理盐水组,TRIM3 1+/++AngⅡ组,TRIM31-/-+AngⅡ组）血清中炎症相关指标,结果显示泵入AngⅡ后,小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-iβ的表达量明显增加,与TRIM31+/+小鼠对比,TRIM31-/-小鼠增加的更为显着。利用巨噬细胞表面Marker CD68抗体对4组小鼠肾脏进行IHC染色,结果显示泵入AngⅡ后,巨噬细胞浸润明显增加,与TRIM31+/+小鼠对比,TRIM31-/-进一步加重了HRD小鼠的肾脏组织中巨噬细胞的浸润。同时IHC、Western blot和RT-PCR的方法检测4组小鼠肾脏炎症指标表达量,结果同样提示与TRIM31+/+小鼠对比,TRIM31基因敲除后明显增强小鼠肾脏组织中炎症相关分子TNF-α、IL-6、IL-1β的表达。8.TRIM31在HRD患者肾活检组织中的表达明显下降利用IHC的检测方法,我们发现与非高血压患者的正常癌旁肾组织Control和非高血压的GML活检肾组织相比,HRD患者的肾组织切片中TRIM31的表达量明显下调。实验结论1.TRIM31在HRD的病理组织中蛋白表达量降低。2.TRIM31基因缺失明显加重了小鼠高血压肾功能损害、纤维化和炎症反应。研究背景炎症和纤维化是高血压肾病（Hypertensive Renal Disease,HRD）的两个主要病理特征,血管紧张素Ⅱ（AngiotensionⅡ AngⅡ）在诱发肾脏组织发生炎症和纤维化的过程中发挥着关键作用。转化生长因子β1（Transfoiming growth factor-beta 1,TGF-β1）是HRD炎症、纤维化发病机理中的主要调控因子。TGF-β1可诱导细胞外基质（Extracellular Matrix,ECM）的生成和沉积、促进成纤维细胞的增殖和分化和上皮细胞的转分化等病理过程。机制方面,TGF-β1主要通过介导Smad依赖的信号通路和非Smad依赖的信号通路（主要是MAPKs和NF-kB信号通路）的活化来调控肾脏纤维化及肾脏炎症,靶向抑制TGF-β1下游信号通路的激活对HRD的治疗具有重大意义。研究显示,Angll可诱导肾脏过度分泌TGF-β1等细胞因子,并进一步通过TGF-β1加重高血压肾损伤。探讨TGF-β1信号通路的调控机制,有利于进一步阐明高血压肾病的发病原因,并为高血压肾病药物研发提供理论依据。TGF-β-activated kinase 1（TAK1）是一种丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶（Mitogen-activated protein kinase kinase kinase,MAP3K）。TAK1的激酶活性受到TGF-β1等多种细胞因子的调控。研究显示,活化的TAK1进一步磷酸化TGF-β1信号通路下游关键接头蛋白,在非Smad依赖的信号通路（主要是MAPKs和NF-kB）的活化及炎症因子的产生过程中发挥着关键作用。然而,在HRD发生发展过程中,TAK1是否同时参与调控TGF-β1介导的经典Smad信号通路及肾脏纤维化进展仍有待进一步的研究阐明。泛素化修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰,是泛素本身通过7个内部的赖氨酸（K6、K11、K27、K29、K33、K48和K64）形成多聚泛素链。E3泛素连接酶决定了泛素分子结合到靶蛋白的特异性,因此也是蛋白质泛素过程中最关键的分子。蛋白质泛素化修饰在多种疾病发生发展过程中发挥着关键作用。研究蛋白质泛素化修饰调控HRD发生的分子机制,并寻找新型治疗靶点具有重要的科学意义和临床价值。已有文献报道,蛋白泛素化修饰在TGF-β1下游信号转导以及TAK1生物学功能的发挥着重要的作用,然而相关的E3泛素连接酶有待进一步的发现。在我们第一部分研究中已证实The tripartite motif 31（TRM31）参与并调控HRD小鼠肾功能损伤、纤维化和炎症反应。TRIM31是否通过调控TGF-β1信号通路在HRD中发挥作用,以及具体的分子机制有待进一步研究。因此,我们在本研究中提出了以下科学假说:TRIM31可通过泛素化修饰TGF-β1信号通路中的靶蛋白,从而参与到TGF-1P相关信号通路在HRD中的激活,进而在HRD病理进程中发挥保护作用。在本研究中,我们将通过体内和体外实验研究进一步探讨TRIM31在HRD中发挥作用的分子机制,为高血压肾损害的治疗寻找新的靶点。研究目的1.探讨在HRD病理进展中TRIM31对TGF-β1信号通路活化的影响;2.探讨TGF-β1信号通路TRIM31的靶分子;3.探讨TRIM31对靶分子的泛素化修饰情况;4.探讨TAK1在TGF-β1信号通路中的作用。研究方法1.实验动物分组分别选取8周龄雄性TRIM31-/-小鼠和同窝雄性TRJM31+/+小鼠,随机分为四组,每组15只:TRIM31+/++生理盐水组,TRIM31-/-+生理盐水组,TRJM31+/++AngⅡ组,TRIM31-/-+AngⅡ组。2.HRD小鼠模型的建立将预先灌注好AngⅡ的微量渗透泵,分别埋入小鼠的背侧皮下,按照以1000ng/kg/min的泵速持续泵入AngⅡ42天,构建HRD小鼠模型,对照组泵入同等体积的无菌生理盐水。实验结束时,将小鼠进行安乐死,并留取小鼠肾脏进行下一步组织和细胞分子学研究。3.临床髙血压肾病患者肾活检标本收集和检测我们从山东大学病理学教研室获得行肿瘤切除术的无高血压患者的正常癌旁肾组织（Control）、无高血压的肾小球轻微病变（Glomerular minor lesion,GML）患者肾脏活检组织、HRD患者肾脏活检组织样本。利用免疫组化（immunohistochemistry,IHC）检测TGF-β1、Collagen Ⅰ、pSmad3、TAK1、TNF-a、pP65的表达情况。4.细胞培养和处理实验中采用人近端肾小管上皮细胞系（Human proximal renal tubular eβ1thelial cell-2,HK2）、小鼠原代肾小管上皮细胞（Mouse Primary renal tubular eβ1thelial cells,MRPTEβ1C）、人胚肾细胞（HEK-293T）,分别培养在含10%FBS的RPMI1640、高糖DMEM培养基和Eβ1CM-A培养基中,于含5%CO2的37°C孵箱中增殖。主要处理见下:（1）HK2细胞处理:1)选择hTGF-β1作为HRD体外刺激因子。体外培养HK2细胞,给予不同浓度的hTGF-β1（0,2ng/mL,4ng/mL,6ng/mL,8ng/mL,10ng/mL）刺激24h或以10ng/mL的hTGF-β1刺激不同时间（0,4h,8h,12h,24h,36h）,收集细胞;2)体外培养HK2细胞,给予TGF-β1中和抗体预处理后,以10-5 M浓度的AngⅡ刺激HK2细胞时间梯度（0,4h,8h,12h,24h,36h）,提取细胞蛋白;3)体外培养HK2细胞,利用RNAiMAX转染细胞TRIM31的小干扰RNA敲减TRIM31的表达,使用10ng/mL的hTGF-β1刺激细胞0、12h或24h,提取细胞蛋白;4)将构建的将Flag标签的TRIM31-WT、缺失突变体TRIM31-ΔRing以及点突变TRIM31-C53A/C56A过表达质粒利用Lipo3000转染试剂分别转染体外培养的HK2细胞,并利用10ng/mL hTGF-β1刺激细胞0或24h,提取细胞蛋白,进行Western blot实验;5)体外培养HK2细胞,lOng/mLhTGF-β1刺激0.5h或lh后,提取细胞蛋白,进行Western blot或免疫共沉淀实验（Co-immunopreciβ1tation,Co-IP）实验;6)体外培养HK2细胞系,利用TAK1的特异性抑制剂5z-7-oxozeaenol（5z7）抑制TAK1的激酶活性,或利用TAK1的小干扰RNA敲减TAK1的蛋白表达,使用10ng/mLhTGF-β1刺激细胞0.5h和lh后,提取细胞蛋白。（2）MRPTEpiC细胞处理:体外培养MRPTEpiC细胞,利用TAK1的特异性抑制剂5z7抑制TAK1的激酶活性,或者利用TAK1的小干扰RNA敲减TAK1的蛋白表达,使用10ng/mL hTGF-β1刺激细胞0.5h和lh后,提取细胞蛋白。（3）HEK-293T细胞处理:1)将TRAF6、TAK1、Smad2、Smad3及Smad4的过表达质粒,与TRIM31过表达质粒分别共转染入HEK293T细胞系。提取细胞蛋白进行Co-IP实验;2)将GFP标签的TRIM31和Myc标签的TAK1过表达质粒共转染HEK293T细胞系,进行细胞免疫荧光染色;3)将TRIM31不同的截断突变体（TRIM31-ΔRing,TRIM31-AB,TRIM31-AC-C,TRIM31-AC）和TAK1的不同截断突变体（l-300aa,l-480aa,30I-579aa）,分别与野生型TAK1或者野生型TRIM31过表达质粒共转染入HEK293T细胞系,提取细胞蛋白进行Co-IP实验;4)将不同浓度的Flag-TRIM31过表达质粒与相同浓度Myc-TAKl过表达质粒共转染HEK293T细胞系,提取细胞蛋白;5)将Flag-TRIM31与Myc-TAKl过表达质粒共转染HEK293T细胞系后培养24h,提取细胞蛋白前4h分别加入蛋白酶体途径抑制剂Bortezomib和溶酶体途径抑制剂氯喹（chloroquine）,提取细胞蛋白;6)将Flag标签的TRIM31-WT、TRIM31-ARing以及TRM31-C53A/C56A与Myc-TAKl过表达质粒共转染HEK293T细胞系24h,提取细胞蛋白;7)将HA标签的不同类型（WT、K48或K63）泛素过表达质粒,与Flag-TRIM31、Myc-TAKl过表达质粒共转染HEK293T细胞系24h,提取细胞蛋白,进行CO-1P实验;8)将TAK1赖氨酸点突变过表达质粒Myc-TAK1-K72R、Myc-TAK1-K158R,分别与Flag-TRIM31和HA标签的泛素过表达质粒共转染HEK293T细胞系,24h后提取蛋白,进行CO-IP实验。5.小鼠组织样本取材造模结束后将小鼠进行安乐死,留取小鼠肾脏标本,剥除肾脏包膜后,分别放于液氮保存或者放于4%多聚甲醛中固定2448h以待后续实验使用。6.小鼠肾脏组织制备和IHC染色将固定在4%多聚甲醛中的4组小鼠肾脏组织脱水包埋成蜡块,制备石蜡切片（厚度:4pn）。利用IHC染色的方法检测4组小鼠肾脏组织中TGF-β1的表达差异。7.组织RNA提取、反转录和实时荧光定量（Real-time PCR,RT-PCR）提取4组小鼠肾脏组织和HK2细胞的RNA,利用TAKARA反转录试剂盒进行mRNA的反转录,然后通过RT-PCR获得目的基因八Ⅰ、collagen Ⅲ、collagen Ⅳ、Jibronectin、a-sma、tnf-a、il-6和il-1β办的Ct值,利用P-actin作为内参,将所得的Ct值,采用2-AACT公式计算目的分子的相对表达量的变化。8.Western blot分析利用蛋白提取试剂盒提取4组小鼠肾脏组织蛋白,或利用细胞裂解液提取HK2、HEK293T或MRPTEβ1C细胞蛋白,BCA调定蛋白浓度后进行SDS-PAGE凝胶电泳,检测各个目的分子的蛋白含量。9.激光共聚焦检测TRIM31与TAK1的共定位将GFP标签的TRIM31和Myc标签的TAK1过表达质粒共转染HEK293T细胞系,细胞免疫荧光染色后,利用激光共聚焦显微镜检测TRIM31与TAK1在细胞内的共定位情况。10.表达载体和点突变的构建通过目的基因的引物设计、扩增、酶切和连接等步骤进行重组质粒和点突变质粒的构建和抽提,用于进一步的过表达和体外转录翻译实验。11.免疫共沉淀魏（Co-IP）体外培养HK2,利用内源性抗体进行Co-IP检测内源性目的分子的结合。体外培养HEK293T细胞,并构建各种目的分子的过表达质粒转染细胞,利用标签抗体进行Co-IP检测内源性目的分子的结合。体外翻译系统表达目的分子蛋白,利用标签抗体进行Co-IP检测目的分子的外源性结合。12.细胞转染体外培养HK2、HEK293T或MRPTEβ1C细胞,将TRIM31或TAK1的小干扰RNA利用RNAiMAX转染细胞,敲减目的基因的表达。将过表达质粒利用Lip3000转染细胞进行目的基因的过表达。13.体外翻译系统进行体外蛋白表达实验构建含有T7启动子的PCDNA3.1过表达质粒,利用Promega公司的TNT Quick Coupied Transcription/translation System试剂盒进行网织红细胞体外转录翻译系统,或者利用Mini Expression Module试剂盒进行大肠杆菌体外翻译对TAK1和TRIM31等表达质粒进行体外转录翻译。14.体外泛素化修饰实验将体外翻译系统获得的蛋白加入BostonBiochem公司的体外泛素修饰系统（包含有El,UbcH5a,K48,K63等蛋白）,室温反应30分钟后,利用Western blot的方法检测体外泛素化修饰的情况及泛素化修饰的类型。15.数据统计分析方法所有数据使用GraphPad Prism 8软件进行分析,表示为均数（mean）土标准误（SEM）。采用Shapiro-Wilk检验进行数据分布的正态性假设的评估。采用非配对t检验分析正态分布的单因素数据中两组间的统计差异,采用单因素方差分析分析正态分布的的多组间的统计差异。对于具有两个变量的多组数据,验证数据属于正态分布后,使用双因素方差分析进行分析其统计差异。不属于正态分布的数据,使用Kruskal-Wallis检验进行非参数统计分析。在所有的统计比较中,p值小于0.05为有统计学意义。研究结果1.TGF-β1参与了AngⅡ诱导的小鼠高血压肾损害TGF-β1是高血压肾损伤和肾小管间质纤维化的关键细胞因子。Western blot、IHC和RT-PCR检测发现,TGF-β1在AngⅡ诱导的小鼠HRD的肾脏组织中的表达量明显增加,说明TGF-β1参与了HRD的疾病进展。同时,TGF-β1的表达量在TRIM31+/+和TRIM31I小鼠之间没有统计学差异,说明TRIM31的基因敲除并不影响TGF-β1在HRD肾脏中的表达量。2.TGF-β1抑制TRIM31的蛋白表达Western blot及RT-PCR结果显示,伴随hTGF-β1刺激HK2细胞不同时间或利用不同浓度的hTGF-β1刺激细胞,肾小管上皮细胞中TRIM31的表达均呈现显着降低。这些结果说明TGF-β1抑制TRIM31基因的转录和翻译,并提示TRIM31可能参与TGF-β1介导的信号通路。而在给予TGF-β1中和抗体预处理的情况下,Angll导致TRIM31蛋白水平下降的情况得以恢复。以上提示TGF-β1负向调控TRIM31的蛋白表达,而Angn对TRIM31的蛋白表达调控可能是通过TGF-β1发挥的。3.TRIM31负调控hTGF-β1介导的肾小管上皮细胞的纤维化及炎症反应Western blot和RT-PCR检测结果显示,TRIM31基因敲减能明显加重hTGF-β1诱导的肾小管上皮细胞纤维化进程和炎症相关指标的表达。野生型TRIM31基因过表达可明显改善hTGF-β1诱导的肾小管上皮细胞的纤维化进程和炎症相关指标的表达。而过表达缺失E3泛素连接酶活性的TRIM31 Ring结构域缺失突变体TRIM31-ARing以及E3泛素连接酶活性缺失点突变过表达质粒TRIM31-C53A/C56A不影响hTGF-β1诱导的肾小管上皮细胞的纤维化进程和炎症相关指标的表达。以上结果说明,TRIM31通过其E3泛素连接酶活性抑制hTGF-β1诱导的肾小管上皮细胞的纤维化进程和炎症反应。4.TRIM31介导了TGF-β1信号的通路活化经典Smad信号通路以及非Smad信号通路在肾脏纤维化过程中发挥着重要作用,其中Smad2、Smad3的磷酸化代表经典Smad信号通路活化,ERK、JNK、P38、NF-κB的磷酸化代表非Smad信号通路的活化。提取4组小鼠(TRIM31+/+生理盐水组,TRIM31-/+生理盐水组,TRIM31+/++AngⅡ组,TRIM31-/-+AngⅡ组)肾脏蛋白,Western blot检测显示,相比野生型小鼠HRD肾脏组织,TRIM31-/-HRD小鼠肾脏组织中Smad2、Smad3、ERK、JNK、P38、NF-κB磷酸化明显升高。体外培养HK2细胞,发现TRIM31基因敲减同样能明显增强TGF-β1诱导的经典Smad信号通路以及非Smad信号通路的活化水平。以上结果说明TRIM31可负向调控TGF-β1信号通路的活化水平。5.明确了TGF-β1信号通路中TRIM31的靶分蛋白前期结果表明TRIM31可调控TGF-β1介导的信号通路,我们将重点寻找该信号通路中TRIM31作用的靶蛋白。将TGF-β1信号通路中关键接头分子TRAF6、TAK1、Smad2、Smad3及Smad4等的过表达质粒与TRIM31过表达质粒分别共转染入HEK293T细胞系。利用Co-IP实验检测发现TRIM31与TRAF6、TAK1发生了明显的结合。同时体外培养HK2细胞,hTGF-β1刺激不同时间点后,利用TRIM31特异性抗体进行Co-IP实验,同样检测到了内源性TRIM31与TAK1、TRAF6的结合,同时发现伴随着hTGF-β1刺激时间的增加,HK2细胞中TRIM31与TAK1的结合呈现增多的趋势。以上结果提示TAK1、TRAF6可能是TGF-β1信号通路中TRIM31调控的靶分子。6.TRIM31靶向降解TAK1将浓度梯度的TRIM31过表达质粒与TRAF6或TAK1过表达质粒分别共转染HEK293T细胞系,利用Western blot的方法检测到TRIM31可降低TAK1蛋白表达量,并且存在浓度梯度依赖性。然而,TRM31的过表达并不影响TRAF6的蛋白表达量。我们同时发现,转染TRIM31-ARing以及TRIM31-C53A/C56A过表达质粒不影响TAK1的蛋白表达量。以上结果说明,TRIM31可通过其E3泛素连接酶活性特异性降解TAK1,而对TRAF6的蛋白表达无影响。至此,我们确定TAK1为TGF-β1信号通路中TRIM31的结合及降解靶点。7.TRIM31对TAK1进行了蛋白酶体途径的降解泛素-蛋白酶体途径和自噬-溶酶体途径是体内蛋白质发生降解的主要途径。我们将Flag标签的TRIM31过表达质粒与Myc标签的TAK1过表达质粒共转染HEK293T细胞系,培养24h后分别加入蛋白酶体途径抑制剂Bortezomib和溶酶体途径抑制剂chloroquine处理4h,提取细胞蛋白,利用Western blot的方法检测到蛋白酶体抑制剂Bortezomib可恢复TRIM31介导的TAK1降解,而溶酶体抑制剂chloroquine对TRIM31介导的TAK1降解无影响。以上说明TRIM31通过蛋白酶体途径介导TAK1的降解。8.TRIM31与TAK1在细胞浆中共定位将GFP标签的TRIM31和Myc标签的TAK1过表达质粒共转染HEK293T细胞系,细胞免疫荧光染色后,利用激光共聚焦显微镜检测发现TRIM31与TAK1在细胞中存在明显的共定位。9.TRIM31与TAK1体外结合利用大肠杆菌和网织红细胞体外翻译系统分别获得TRIM31和TAK1的体外表达蛋白,利用glutathione S-transferase（GST）pull-down实验和Co-IP的方法检测到体外表达的TRIM31与TAK1蛋白可发生直接结合。10.TRIM31与TAK1发生结合的结构域通过构建一系列TRIM31与TAK1的关键结构域截断突变体,共转染HEK293T细胞系,Co-IP实验表明TRIM31的130-425氨基酸序列与TAK1的1-300氨基酸序列分别在TRIM31与TAK1的结合中发挥着重要作用。11.TRIM31对TAK1进行了泛素化修饰前期结果证明TRIM31介导了TAK1蛋白酶体途径的降解,TRIM31作为E3泛素连接酶家族的一员,我们进一步探索了TRIM31是否是通过泛素化修饰TAK1进而介导其发生蛋白酶体途径降解。将泛素过表达质粒、TRIM31过表达质粒、TAK1过表达质粒共转染HEK293T细胞系,Co-IP实验表明TRIM31明显促进了TAK1的泛素化修饰,过表达泛素连接酶活性关键结构域缺失突变体TRIM31-ARing以及泛素连接酶活性缺失点突变体TRIM31-C53A/C56A则没有此作用,说明TRIM31可促进TAK1的泛素化修饰,这一作用与TRIM31的E3泛素连接酶功能密切相关。作为对照,TRM31并不能促进接头分子TRAF6的泛素化修饰。12.证明TRIM31促进TAK1进行了K48位泛素化修饰前面验证了TRIM31可对TAK1进行泛素化修饰,为进一步探索TRIM31对TAK1进行泛素化修饰的类型,我们分别将不同类型（WT、K48或K63）的泛素过表达质粒,与TRIM31过表达质粒、TAK1过表达质粒共转染HEK293T细胞系,泛素化实验表明TRIM31可明显促进TAK1 K48位的泛素化修饰。同时培养HK2细胞系,利用TRIM31小干扰RNA敲减TRIM31的表达,hTGF-β1刺激后,提取细胞蛋白,利用TAK1特异性抗体进行Co-IP,结果显示TRIM31同样可介导内源性TAK1蛋白的K48位的泛素化修饰。13.发现了TRIM31对TAK1进行泛素化修饰的具体位点为了进一步探索TRIM31对TAK1上哪个赖氨酸位点进行了泛素化修饰,我们通过查阅文献发现TAK1上第158位赖氨酸位点和第72位赖氨酸位点可能发生泛素化修饰,但调控这2个位点进行修饰的E3泛素连接酶却一直没有被发现。我们进一步构建了K158位和K72位赖氨酸突变的TAK1过表达质粒,分别与TRIM31过表达质粒和K48泛素过表达质粒共转染HEK293T细胞系,通过泛素化实验检测发现TRIM31可对TAK1第72位赖氨酸进行了K48位的泛素化修饰。14.利用体外蛋白拥译系统和体外泛素化系统验证了TRIM31对TAK1的泛素化修饰为了进一步探索TRIM31是否直接对TAK1进行泛素化修饰,我们将TAK1和TRIM31分别构建到含有T7启动子的PCDNA3.1-Myc过表达质粒上和含有T7启动子的PCDNA3.1-Flag过表达质粒上,然后利用Promega公司的TNT体外转录翻译系统对TAK1和TRIM31的表达质粒进行体外转录翻译,将翻译后的蛋白加入BostonBiochem公司的体外泛素化修饰系统,利用Western blot的方法进一步证明了TRM31对TAK1进行了K48位的泛素化修饰。同时构建只保留K72位赖氨酸残基（Myc-TAK1-K72）和只突变掉K72赖氨酸残基（Myc-TAK1-K72R）的TAK1的点突变过表达质粒,并进行体外转录翻译得到Myc-TAKl、Myc-TAK1-K72、Myc-TAK1-K72R、FIag-TRIM31的蛋白,然后加入体外泛素化修饰系统,同样发现TRIM31只对含有K72位赖氨酸残基的TAK1进行泛素化修饰。以上结果共同说明了TRIM31可直接对TAK1的第72位赖氨酸进行K48位的泛素化修饰。15.TAK1介导了TGF-β1信号通路的活化体外培养HK2细胞系以及小鼠原代肾小管上皮细胞MRPTEβ1C,利用TAK1的抑制剂5z7抑制TAK1的激酶活性或者利用Si-RNA敲减TAK1的表达后,hTGF-β1介导的Smad2、Smad3、ERK、JNK、P38、NF-kB磷酸化表达水平均明显下降。以上说明,在肾小管上皮细胞中,TAK1同时参与调控TGF-P1信号通路中经典Smad信号通路以及非Smad信号通路的活化。16.临床患者TAK1、炎症、纤维化和TGF-β1信号通路与HRD的相关性从山东大学病理学教研室获得行肿瘤切除术的无高血压患者的正常癌旁组织、无高血压的GML患者肾活检组织、HRD患者肾活检组织切片,并进行IHC检测。结果发现纤维化水平代表性指标Collagen Ⅰ、炎症水平代表性指标TNF-α、TGF-β1信号通路活化代表指标（TGF-β1、pSmad3、pP65）、以及TAK1的表达在HRD活检组织样本中明显增加。这些结果进一步提示我们,TAK1在HRD肾脏纤维化、炎症反应及疾病进展中可能发挥着重要作用。同时,伴随HRD疾病进展,TRIM31表达逐渐降低可能是导致TAK1表达升高及HRD疾病加重的重要原因。实验结论1.TRIM31参与了TGF-β1介导的肾脏纤维化和炎症反应;2.TRIM31通过靶向调控TAK1 K48位的泛素化修饰和蛋白酶体途径的降解进而负调控TGF-β1下游经典Smad信号通路以及非Smad信号通路的活化,最终改善高血压肾损害。
潘雅婧[5]（2020）在《肾康注射液调节UUO小鼠肾纤维化及HUVEC血管生成的机制研究》文中研究表明目的:以VEGF为切入点,在动物和细胞实验探讨肾康注射液对UUO小鼠肾纤维化和HUVEC血管生成的调控作用及作用机制。方法:1.动物实验:将雄性C57BL/6小鼠随机分为假手术组（sham）、单侧输尿管梗阻组（UUO）、氯沙坦钾组（ARB）及高、中、低剂量肾康组（SKI-H、SKI-M、SKI-L）。除sham组外的各组行UUO手术;次日ARB组予氯沙坦钾（13 mg/kg·d）灌胃;SK]-H、SKI-M、SKI-L 组分别予 7.8 g/kg·d、3.9 g/kg·d、1.95 g/kg·d SKI 尾静脉注射。观察小鼠一般状态、记录体重变化。给药14天后检测血Scr、BUN、CysC水平;micro-CT检测肾脏血管分布;HE染色观察肾组织形态改变;天狼星红染色观察胶原沉积;IHC染色观察VEGF、VEGFR-2表达。2.细胞实验:将HUVEC分为空白组（CON）、SKI高剂量组（SKI-11）、SKI-低剂量组（SKI-L）、VE GF 沉默组（Si）、VEGF 沉默-SKI 高剂量组（Si-SKI-H）、VEGF 沉默-SKI 低剂量组（Si-SKI-L）。SKI-H、SKI-L 组分别予 8 mg/ml、2 mg/ml SKI干预 24 h;Si组通过RNAi转染沉默VEGF基因;Si-SKI-H、Si-SKI-L组在转染同时分别予8 mg/ml、2 mg/ml SKI干预24 h。观察血管生成情况,计算血管生成参数;real-time PCR和western blot法分别检测VEGF通路重要靶点基因和蛋白表达。结果:1.动物实验:给药14天后UUO组体重较sham组减轻（P<0.01）;ARB、SKI-H、SKI-M组体重较UUO组增高（P<0.05）。UUO组Scr、BUN、CysC水平较sham组升高（P<0.05,P<0.01）;ARB、SKI-H 组 Scr、BUN、CysC 水平较 UUO 组降低（P<0.05,P<0.01）。肉眼观察sham组双肾无明显异常改变;UUO组患侧肾脏表面粗糙、膨大、积水,肾盂肾盏扩张,实质变薄;SKI组患肾结构破坏较UUO组减轻。micro-CT见sham组肾血管密集,走向清晰;UUO组患肾血管疏松,分支减少、曲度下降;SKI组患肾血管损伤较UUO组减轻。HE染色见sham组肾脏结构完整,无明显病理损害;UUO组肾小管扩张,上皮细胞肿胀坏死,间质增宽伴炎性浸润;SKI组肾脏损伤较UUO组减轻。天狼星红染色（光镜）见sham组肾脏几乎无红染胶原;UUO组肾间质大量红色胶原聚集;SKI组红染程度较UUO组减轻。偏振光镜荧光信号变化与普通光镜所见大体一致。IHC示UUO组患肾VEGF、VEGFR-2表达较sham组降低（P<0.01）;SKI 组 VEGF、VEGFR-2 表达较 UUO 组降低（P<0.01）。剂量方面,SKI 减轻肾脏纤维化损伤和促进血管生成,以中、高剂量效果更优。2.细胞实验:沉默VEGF 24 h后Si组VEGF基因表达较CON组显着降低（P<0.01）,阴性对照组与CON组VEGF无显着差异（P>0.05）,验证转染稳定可行。血管生成方面,SKI组血管连接较CON组增多、血管网密度增大,血管生成参数提高,SKI促进HUVEC血管生成（P<0.01,P<0.05）。基因表达方面,与CON组相比,SKI-H 组 VEGF、VEGFR-2、eNOS 水平升高（P<0.05,P<0.01）;与 Si 组相比,Si-SKI-H 和 Si-SKI-L 组 VEGF、eNOS 水平升高（P<0.05,P<O.01）,SKI 上调 VEGF 通路靶点基因,且该效应在VEGF沉默时更突出。蛋白表达方面,在正常培养及VEGF沉默状态,SKI 均提高 VEGFR-2、p-VEGFR-2、eNOS、p-eNOS 表达水平（P<0.05,P<0.01）。结论:1.肾康注射液可改善UUO小鼠肾功能,缓解肾纤维化病理改变,减轻纤维化损伤;可缓解肾脏微血管网损伤,上调VEGF、VEGFR-2表达,促进患侧肾脏血管生成。2.肾康注射液可促进HUVEC血管生成;可上调HUVEC的VEGF、VEGFR-2基因表达;可提高VEGFR-2、eNOS总蛋白水平及磷酸化蛋白水平。3.肾康注射液可能通过调节VEGF/VEGFR-2及下游eNOS来改善肾纤维化损伤和促进血管生成。
杜娜[6]（2019）在《益肾活血方颗粒抗大鼠早期糖尿病肾病作用及机制的研究》文中提出益肾活血方颗粒是由人参皂苷、黄芪、五味子等六味中药组方而成的中医临床经验方颗粒剂。临床实践发现,益肾活血方颗粒具有稳定早期糖尿病肾病（Diabetic Nephropathy,DN）患者血糖水平和改善肾脏功能的治疗作用,但缺乏治疗效果的有效证据和作用机制的系统研究。而且中药复方制剂存在化学成分复杂、药效物质和体内代谢过程不明确、质量标准难以控制等问题。因此,探究益肾活血方颗粒对早期DN的治疗作用及机制、简化复方成分得到化学结构明确且疗效确切的有效成分,不但可增加益肾活血方颗粒在临床上的应用,降低不良反应的发生率,而且可扩大中药产品在国际市场的应用,实现中药现代化开发,同时为抗DN新药的研发提供新思路。基于网络药理学和现代中药药理研究,我们以君药（人参皂苷和黄芪）的化学单体成分为研究对象,通过对文献进行深度文本挖掘,着眼于抗氧化应激和抑制TGF-β1/Smads信号通路传导,遴选并最终确定人参皂苷Rg1（Rg1）和黄芪甲苷（AS-IV）为益肾活血方颗粒的主要药效成分。本论文旨在探究益肾活血方颗粒及其主要药效成分Rg1联合AS-IV,对链脲佐菌素（Streptozocin,STZ）诱导的早期DN大鼠的作用及机制。具体研究如下:一、益肾活血方颗粒对大鼠早期DN影响的研究研究方法:构建STZ诱导的早期DN大鼠模型并随机分组给药:STZ组[10ml/kg/d生理盐水,灌胃（ig）]、贝那普利组（1mg/kg/d贝那普利,ig）、益肾活血方颗粒低剂量组（0.5g/kg/d益肾活血方颗粒,ig）、中剂量组（1.0g/kg/d益肾活血方颗粒,ig）和高剂量组（2.0g/kg/d益肾活血方颗粒,ig）,另取未造模大鼠为对照组（10ml/kg/d生理盐水,ig）。每天给药1次,连续给药8周后,收集大鼠24h尿液样本、血液样本、肾脏组织样本。检测尿液中β2-MG、mALB和UCr水平;检测血清中BUN、UREA、SCr、NOS、CAT、GSH-PX、MDA和T-AOC水平;左侧肾脏进行H&E和PAS病理分析,以及TGF-β1、Smad2/3和Smad7的免疫组化检测;右侧肾脏进行TGF-β1、Smad2/3、Smad7和CTGF的western blot检测。研究结果:与STZ组比较,益肾活血方颗粒中、高剂量组:1)显着降低肾脏肥大指数（p<0.01）、24hUV（p<0.001）、β2-MG（p<0.001）、mALB（p<0.001）、UAER（p<0.001）、UCr（p<0.001）、SCr（p<0.001）、UREA（p<0.001）和BUN（p<0.001）水平,增加BW（p<0.001）和CCr（p<0.05）水平,有效改善大鼠肾脏功能;2)抑制肾小球肿胀,保护系膜结构,降低病变肾小球比率,改善大鼠肾脏病理;3)显着增加NOS（p<0.05）、CAT（p<0.001）、GSH-PX（p<0.001）和T-AOC（p<0.001）水平,降低MDA（p<0.001）水平,有效降低大鼠氧化应激水平;4)明显降低大鼠肾脏组织因STZ诱导引起的TGF-β1、Smad2/3和CTGF过表达,增加Smad7的表达水平,有效抑制TGF-β1/Smads信号通路传导;5)确定1.0g/kg为DN大鼠的最佳治疗剂量。二、益肾活血方颗粒主要有效成分的筛选与测定研究方法:在对文献进行深度文本挖掘基础上,遴选Rg1和AS-IV为益肾活血方颗粒的主要药效成分。建立Rg1和AS-IV的LC-MS检测方法,并进行方法学考察。测定益肾活血方颗粒中Rg1和AS-IV的含量。取大鼠随机分组给药:中剂量组（1.0g/kg益肾活血方颗粒,ig）、Rg1组（中剂量组中Rg1的等剂量,ig）、AS-IV组（中剂量组中AS-IV的等剂量,ig）和Rg1+AS-IV组（中剂量组中Rg1+AS-IV的等剂量,ig）。分别于给药后0h、5min、15min、0.5h、1h、2h、4h、6h、12h和24h检测各组大鼠血液中Rg1和AS-IV的浓度,分析药时曲线。研究结果:1)自建LC-MS法对Rg1和AS-IV检测的方法学参数良好。2)益肾活血方颗粒中Rg1含量为50mg/g,AS-IV含量为16mg/g,以此为Rg1联合AS-IV的用药浓度。3)与Rg1组相比,Rg1+AS-IV组和中剂量组在给药后15min24h血浆Rg1浓度（p<0.05）、AUC0-∞（p<0.05）、Cmax（p<0.05）、C24h（p<0.01）显着升高;而Rg1+AS-IV组与中剂量组比较无显着性差异。4)与AS-IV组比较,Rg1+AS-IV组和中剂量组在给药后15min6h血浆AS-IV浓度（p<0.01）、AUC0-∞（p<0.05）和Cmax（p<0.05）显着升高;Rg1+AS-IV组与中剂量组比较无明显差异。三、Rg1+AS-IV抗大鼠早期DN的作用及机制研究方法:构建STZ诱导的早期DN大鼠模型并随机分组给药:STZ组（10ml/kg/d生理盐水,ig）、中剂量组（1.0g/kg/d益肾活血方颗粒,ig）、Rg1组（50mg/kg/d Rg1,ig）、AS-IV组（16mg/kg/d AS-IV,ig）和Rg1+AS-IV组（50mg/kg/d Rg1+16mg/kg/d AS-IV,ig）,另取未造模大鼠为对照组（10ml/kg/d生理盐水,ig）。每天给药1次,连续给药8周后,收集大鼠24h尿液样本、血液样本、肾脏组织样本。检测尿液中β2-MG和UCr水平;检测血清中BUN、SCr、CAT、GSH-PX、MDA和T-AOC水平;左侧肾脏进行H&E病理分析,以及TGF-β1、Smad2/3、Smad7和CTGF的免疫组化检测;右侧肾脏进行TGF-β1、Smad7和CTGF mRNA的Real-Time PCR检测。研究结果:与STZ组比较,Rg1组、AS-IV组和Rg1+AS-IV组均可以:1)增加大鼠BW（p<0.05）和CCr（p<0.05）水平,降低24hUV（p<0.05）、β2-MG（p<0.05）、UCr（p<0.05）、SCr（p<0.05）和BUN（p<0.05）水平,提高早期DN大鼠肾脏功能;2)维持肾小球体积正常,保护肾小球系膜和基底膜结构,降低病变肾小球比率,改善早期DN大鼠肾脏病理;3)增加CAT（p<0.05）、GSH-PX（p<0.05）和T-AOC（p<0.05）水平,降低MDA（p<0.05）水平,增加机体抗氧化应激水平;4)显着降低大鼠肾脏TGF-β1（p<0.05）、Smad2/3（p<0.05）和CTGF（p<0.05）的表达水平,增加Smad7（p<0.05）的表达水平。明显降低TGF-β1和CTGF的转录,升高Smad7（p<0.05）的转录,有效抑制早期DN大鼠肾脏TGF-β1/Smads信号通路传导。由Rg1组、AS-IV组和Rg1+AS-IV组比较可知:1)Rg1组对改善早期DN大鼠肾脏功能和抗氧化应激作用优于AS-IV组;2)AS-IV组对TGF-β1/Smads信号通路传导的抑制作用优于Rg1组;3)Rg1+AS-IV组对早期DN大鼠的肾脏保护、抗氧化应激和抑制TGF-β1/Smads信号通路传导作用,优于Rg1组和AS-IV组。由Rg1+AS-IV组与中剂量组比较可知:Rg1+AS-IV组与中剂量组对早期DN大鼠的肾脏保护作用、增强抗氧化应激和抑制TGF-β1/Smads信号通路传导作用无显着差异;Rg1+AS-IV组对早期DN大鼠肾脏Smad7和CTGF转录水平的影响弱于中剂量组,但Rg1+AS-IV组与中剂量组在Smad7和CTGF翻译水平的影响无明显差异。以上研究结果表明:益肾活血方颗粒对STZ诱导的早期DN大鼠有良好的治疗作用,其肾脏保护作用与抗氧化应激和抑制TGF-β1/Smads信号通路传导有关。基于这两方面的作用机制,通过文本挖掘和LC-MS方法检测,确定益肾活血方颗粒中人参皂苷Rg1（50mg/g）联合AS-IV（16mg/g）对STZ诱导的早期DN大鼠的肾脏保护作用、增强抗氧化应激和抑制TGF-β1/Smads信号通路传导作用与益肾活血方颗粒相当,为探寻益肾活血方颗粒有效组分的深入研究提供重要依据。
张紫森[7]（2019）在《周细胞对脓毒症大鼠血管舒缩和屏障功能的协同保护作用及机制》文中认为脓毒症是ICU中常见的危重病症,其发生率和死亡率均很高。据统计,我国每年有300万脓毒症患者,约100万人死于脓毒症。脓毒症和脓毒性休克的后期会出现血管功能障碍,即血管低反应性和血管渗漏,最终导致多器官功能衰竭,ICU中30%-40%的病人死亡与血管低反应性和血管渗漏有关。针对脓毒症血管低反应性和血管渗漏的发生机制,提出了一系列的治疗措施,但这些措施在纠正血管低反应性和血管渗漏过程中存在矛盾现象,如用缩血管药物增加血管反应性的同时,会导致血管内皮细胞骨架蛋白收缩,加重血管渗漏。目前临床上缺乏协同治疗血管低反应性和血管渗漏的措施。周细胞（Pericyte,PC）是位于小血管、微血管和毛细血管内皮细胞周围、基底膜内的一群具有收缩、分泌和多项分化潜能的细胞。近年来研究发现,周细胞参与炎症、免疫紊乱、血管异常增生等病理生理过程,在多种疾病如癫痫、阿尔兹海默症、糖尿病、心肌缺血、肺纤维化的发生发展过程中发挥重要作用。而周细胞能否协同调控和保护脓毒症后血管舒缩和屏障功能,及其主要作用机制是什么,目前尚不清楚。据此,本研究利用盲肠结扎穿孔（Cecal Ligation and Puncture,CLP）及静脉注射LPS复制SD大鼠和转基因小鼠脓毒症模型,以及LPS刺激血管平滑肌细胞（VSMC）和血管内皮细胞（VEC）,分别从整体及离体水平研究了周细胞对脓毒症血管反应性和血管通透性的协同保护作用及机制。研究内容:第一部分脓毒症周细胞结构和功能的变化及与血管反应性和血管通透性的关系利用CLP及静脉注射LPS复制脓毒症大鼠及小鼠（周细胞荧光标记）模型,观察脓毒症后不同时相点（6h、12h、24h）肠系膜血管周细胞数量和结构的变化;观察肠系膜血管舒缩反应性和血管通透性的变化,及其相关调节蛋白表达的变化,分析脓毒症后周细胞结构和功能的变化与血管反应性和血管通透性间的关系。第二部分输注外源性周细胞对脓毒症大鼠血管低反应性和血管渗漏的协同保护作用利用脓毒症大鼠模型,输注外源性周细胞和功能增强的周细胞（poly（i:C）预刺激）,观察周细胞在肠系膜微静脉上的定植情况,以及输注周细胞后对脓毒症大鼠肠系膜血管舒缩反应性、血管通透性及存活率的影响,以明确周细胞对脓毒症大鼠血管舒缩功能和屏障功能的协同保护作用。第三部分周细胞敲减大鼠血管反应性和血管通透性的变化及输注外源性周细胞对血管舒缩功能和屏障功能的回复作用用CP-673451（PDGFR-β抑制剂）建立周细胞敲减大鼠模型（药物敲减模型）,观察周细胞敲减大鼠在脓毒症后血管反应性和血管通透性的变化情况,以及输注外源性周细胞对血管反应性和血管通透性的回复作用,以进一步明确周细胞对脓毒症大鼠血管反应性和血管通透性的协同保护作用。第四部分周细胞协同调节血管反应性和血管通透性的作用及机制1.周细胞调节血管平滑肌细胞舒缩功能和血管内皮细胞屏障功能的直接作用利用培养的VSMC和VEC,观察正常和LPS刺激下周细胞与VSMC和VEC间直接接触的情况,以及对VSMC舒缩功能和VEC屏障功能的直接调节作用。2.周细胞微囊泡（PCMV）协同调节血管反应性和血管通透性的作用及机制利用培养的周细胞:（1）观察周细胞和功能增强周细胞分泌微囊泡数量的变化;（2）观察PCMV在VSMC和VEC中的吸收情况;（3）观察PCMV对整体动物和离体细胞血管反应性和血管通透性的影响;（4）观察PCMV及Poly（i:C）PCMV所含生长因子、microRNA的数量、种类的变化,观察这些活性物质对VSMC收缩功能和VEC屏障功能的影响。主要研究结果:第一部分脓毒症周细胞结构和功能的变化及与血管反应性和血管通透性的关系1.大鼠CLP和LPS致脓毒症后,肠系膜微血管周细胞数量明显减少、脱落;肠系膜微动脉舒缩反应性降低、血流速度逐渐减慢、肠系膜上动脉p-MLC20表达降低,肠系膜微静脉血管通透性增加、血管内皮细胞明显肿胀、内皮连续性结构破坏、紧密连接明显开放同时伴有红细胞渗出、肠系膜上静脉ZO-1和VE-cadherin表达降低。结果提示脓毒症后周细胞的脱落与血管低反应性和血管渗漏密切相关。2.周细胞荧光标记的小鼠脓毒症后,肠系膜微静脉及毛细血管PDGFR-β荧光表达降低,微血管周细胞脱落;肠系膜微动脉舒缩反应性降低,血管渗漏增加、血管内皮细胞明显肿胀、血管内皮结构破坏。上述结果进一步证实脓毒症后周细胞的脱落与血管低反应性和血管渗漏密切相关。第二部分输注外源性周细胞对脓毒症大鼠血管低反应性和血管渗漏的协同保护作用输注周细胞可定植于肠系膜微静脉上,在输注后24h定植最多。周细胞输注后可明显提升脓毒症大鼠72h的存活率和存活时间,明显改善脓毒症大鼠血管反应性、血管流速及肠系膜上动脉p-MLC20的表达;改善肠系膜血管屏障功能、改善血管内皮细胞结构和增加连接蛋白表达,功能增强（Poly（i:c）预处理）的周细胞效果更好。提示外源性周细胞对脓毒症血管反应性和血管通透性具有协同保护作用。第三部分周细胞敲减大鼠血管反应性和血管通透性的变化及输注外源性周细胞对血管舒缩功能和屏障功能的回复作用周细胞敲减大鼠肠系膜微血管周细胞数量减少、覆盖率明显降低,血管舒缩反应性明显降低,血管通透性明显增加、血管内皮紧密连接明显开放、血管内皮连接蛋白表达明显降低,周细胞输注后可恢复周细胞减少导致的血管舒缩功能和屏障功能的破坏。脓毒症会加重周细胞敲减大鼠的血管低反应性和血管渗漏,输注外源性周细胞可明显改善周细胞敲减大鼠脓毒症后血管反应性、血流速度和肠系膜上动脉p-MLC20表达,改善血管通透性,增加连接蛋白的表达;功能增强（Poly（i:c）预处理）的周细胞效果更好。提示输注外源性周细胞对周细胞敲减大鼠的血管反应性和血管通透性具有回复作用。第四部分周细胞协同调节血管反应性和血管通透性的作用及机制1.周细胞调节血管平滑肌细胞舒缩功能和血管内皮细胞屏障功能的直接作用周细胞与VSMC和VEC可直接接触形成连接,直接调节VSMC的收缩功能和VEC的屏障功能。2.周细胞微囊泡协同调节血管反应性和血管通透性的作用及机制周细胞可通过产生微囊泡（PCMV）协同改善VSMC舒缩功能和VEC屏障功能。机制研究发现,PCMV可通过携带Ang-1、miR-145和miR-132来发挥对VSMC收缩功能和VEC屏障功能的协同保护作用。miR-145主要作用于VSMC,抑制Sphk2和S1PR1表达,增加S1PR2和p-MLC20的表达,改善血管平滑肌细胞舒缩功能;miR-132主要作用于VEC,抑制Sphk2和S1PR2的表达,增加S1PR1、ZO-1和VE-cadherin的表达,改善血管内皮细胞屏障功能。提示周细胞主要通过分泌微囊泡携带Ang-1、miR-145和miR-132作用于血管平滑肌细胞和血管内皮细胞,实现对脓毒症血管反应性和血管通透性的协同调控和保护作用。结论:1.脓毒症后肠系膜微血管周细胞结构破坏、数量减少、覆盖率降低,在血管低反应性和血管渗漏中发挥重要作用。2.输注外源性周细胞可协同改善脓毒症血管低反应性和血管渗漏。3.周细胞敲减大鼠肠系膜微动脉收缩和舒张反应性明显下降,血管通透性明显增加,输注周细胞后可明显恢复周细胞减少导致的血管舒缩功能和内皮屏障功能损伤。4.周细胞可通过直接接触和分泌微囊泡协同保护脓毒症血管反应性和血管通透性。直接作用主要是周细胞与VSMC和VEC直接接触形成紧密和缝隙连接,产生物理覆盖和调节作用。旁分泌作用主要是周细胞分泌内含多种活性物质的微囊泡来发挥作用,如Ang-1、miR-145和miR-132。一方面周细胞分泌携带Ang-1的微囊泡,传递至VSMC和VEC,增加血管平滑肌细胞舒缩功能和血管内皮细胞屏障功能。另一方面,周细胞通过分泌携带miR-145和miR-132的微囊泡来发挥协同保护作用,其中miR-145主要在血管平滑肌细胞中起作用,它主要是通过降低Sphk2和S1PR1的表达,增加S1PR2和p-MLC20的表达来发挥作用;miR-132主要在血管内皮细胞中起作用,它主要是通过降低Sphk2和S1PR2的表达,增加S1PR1、ZO-1和VE-cadherin的表达来发挥作用。
刘海飞[8]（2016）在《CCN3对TGF-β1诱导的人肾小球系膜细胞胞外基质代谢的影响》文中认为目的：肾小球硬化是慢性肾脏病进展的重要机制,也是终末期肾衰形成的主要原因,其特征是肾小球系膜细胞增生、细胞外基质大量沉积。近年来研究证实,肾母细胞瘤过度表达蛋白（Nephroblastoma overexpressed gene, CCN3/NOV）具有抑制纤维化的作用,但是其对肾小球硬化的影响尚不清楚。本实验旨在探讨CCN3对肾小球系膜细胞胞外基质沉积的影响,为防治肾小球硬化和CKD进展提供新的思路。方法：1、体外培养人肾小球系膜细胞（Human Mesangial cell, HMC）,使用不同浓度（0、0.5、1.0、2.0ng/m、1）转化生长因子β1 （Transforming growth factor-β1, TGF-β1）作用HMC 24h,并且使用终浓度为2.0ng/ml的TGF-β1干预HMC不同时间（0、12、2、48 hour）,运用Western blot技术检测细胞CCN3蛋白表达情况。2、在无血清培养基中加入TGF-β1（2.0ng/ml）1小时前,外源性给予不同浓度（5ng/ml,50ng/ml,500ng/ml） CCN3干预人肾小球系膜细胞或建立高表达CCN3质粒瞬时转染人肾小球系膜细胞,具体分组如下：空白对照组、TGF-β1干预组（2ng/ml）、CCN3 （5ng/ml）+TGF-β1干预组、CCN3 （50ng/ml）+TGF-β1干预组、CCN3（500ng/ml）+TGF-β1干预组、TGF-β1+CCN3质粒干预组、TGF-β1+空白质粒干预组、CCN3质粒干预组、空白质粒干预组。Real Time-PCR技术检测各组纤连蛋白（Fibronectin, FN）、I型胶原蛋白（Type I collagen, COLI）、基质金属蛋白酶-2（Matrix metalloproteinases-2, MMP-2）、基质金属蛋白酶-9（Matrix metalloproteinases-9, MMP-9）、金属蛋白酶组织抑制因子-1（Tissue inhibitor of metalloproteinases-1,TIMP-1） mRNA表达情况,Western blot技术检测各组FN、COLI、 MMP-2、MMP-9、TIMP-1蛋白表达水平,激光共聚焦显微镜技术检测各组FN、COLI的表达情况。结果：（1）TGF-β1可抑制HMC CCN3蛋白的表达,呈浓度和时间依赖性（终浓度为2.0ng/ml作用24小时抑制作用最强）（P<0.05）。（2）与正常对照组相比,TGF-β1组细胞FN及COLI蛋白及RNA表达明显增加（P<0.05）,TGF-β1刺激前1小时给予不同浓度CCN3重组蛋白干预后可显着抑制TGF-β1诱导的上述指标的表达（P<0.05）。其中,在CCN3浓度为5ng/ml时即可显着抑制COLI及FN的表达,抑制效应呈浓度依赖性；（3）与正常对照组相比,TGF-β1组MMP-2、MMP-9蛋白及mRNA水平显着降低（P<0.05）,TIMP-1蛋白及mRNA水平显着升高（P<0.05）,TGF-β1刺激前1小时给予不同浓度CCN3重组蛋白干预后,MMP-2、MMP-9蛋白及mRNA表达均较TGF-β1干预组显着上调而TIMP-1蛋白及mRNA表达较TGF-β1干预组显着下调（P<0.05）。（4）与TGF-β1组相比,内源性转染pcDNA-3.1 （+）-CCN3质粒+TGF-β1干预组FN、COL1及TIMP-1蛋白及mRNA的表达均显着降低,MMP-2、MMP-9蛋白及mRNA表达显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05、P<0.01）。结论：CCN3可通过抑制HMC胞外基质的生成及促进HMC胞外基质降解抑制胞外基质的沉积,在肾小球硬化的防治中具有潜在的应用价值。
郑壬平[9]（2014）在《LeftyA拮抗TGF-β1诱导肾小管上皮细胞分泌基质金属蛋白酶对肾纤维化的影响及机制》文中研究表明背景肾积水等所致肾纤维化,尤其是肾小管间质纤维化（TIF）,几乎是所有的慢性进展性肾脏疾病的共同结局,同时肾纤维化也是判断肾功能预后的重要指标之一。已有研究表明,TGF-β1是一种功能强大的促进纤维变性的纤维生成因子,而LeftyA及其相关蛋白在胚胎发育中能够抑制TGF-β1信号传递。本课题组前期研究发现：肾重度积水患者的肾组织中,LeftyA基因极低表达。据此,我们推断LeftyA蛋白可能具有抗肾脏纤维化的功能。在本研究中,通过构建pcDNA3.str/Neo（+）-TGF-β1真核表达载体,稳定转染人肾小管上皮细胞（HK-2）使之高表达TGF-β1蛋白,从而诱导人肾小管上皮细胞分泌基质金属蛋白酶2和9（MMP-2/9）,而后者导致肾小管上皮肌成纤维母细胞转化（EMT）并对肾小管基膜造成损伤,此公认为肾纤维化的重要机制之一。本研究旨在明确：LeftyA能否拮抗TGF-β1诱导肾小管上皮细胞分泌基质金属蛋白酶,进而减轻肾纤维化。第一部分人TGF-β1基因转染诱导的HK-2细胞MMP-2/9表达变化目的：通过构建pcDNA3.str/Neo（+）-TGF-β1真核表达载体,建立TGF-β1稳定表达细胞系,探讨转染人TGF-β1基因对细胞分泌MMP2/9的影响。方法：以载有TGF-β1的克隆载体pM19-TSimple为模板,PCR反应获得TGF-β1编码区DNA,酶切和连接插入pcDNA3.str/Neo（+）构建TGF-β1真核表达载体,LipofactamineTM2000将此重组质粒转染入HK-2细胞,新霉素（neomycin）筛选,构建TGF-β1稳定表达细胞系；RT-PCR及Western blot检测此稳定转染细胞系中mRNA及TGF-β1蛋白的表达,Western blot检测MMP-2/9蛋白的表达。结果：PCR扩增出TGF-β1编码区片段,酶切、琼脂糖电泳及基因测序均证实pcDNA3.str/Neo（+）-TGF-β1真核表达载体成功构建；新霉素（neomycin）筛选得到高表达TGF-β1蛋白的HK-2细胞系；RT-PCR和Western blot证实此细胞系高表达mRNA及TGF-β1蛋白。Vestern blot证实MMP-2/9表达明显增强。结论：pcDNA3.str/Neo（+）-TGF-β1真核表达载体成功构建,TGF-β1稳定表达细胞系建立,Western blot证实MMP-2/9表达明显增强,为研究LeftyA蛋白抗肾纤维化奠定了基础。第二部分LeftyA拮抗TGF-β1诱导人肾小管上皮细胞分泌MMP-2/9对肾纤维化的影响目的：探讨在人肾小管上皮细胞中LeftyA拮抗TGF-β1诱导分泌基质金属蛋白酶对肾纤维化的影响。方法：通过转染HK-2细胞,建立TGF-β1、LeftyA+TGF-β1稳定表达细胞系,分别观察细胞形态,检测正常HK-2细胞、TGF-β1稳定表达细胞系和LeftyA+TGF-β1稳定表达细胞系中的MMP-2/9蛋白、E-钙粘蛋白（E-cadherin）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）及相应mRNA的表达变化。结果：光镜显示：稳定转染TGF-β1的HK-2细胞呈长梭形,LeftyA转染TGF-β1稳定表达细胞系,可显着抑制这种形态改变。与正常HK-2细胞相比,稳定转染TGF-β1细胞内E-cadherin表达下调,α-SMA与MMP-2/9表达明显上调。在LeftyA转染TGF-β1稳定表达细胞系中,LeftyA蛋白上调表达可显着抑制TGF-β1诱导HK-2细胞内E-cadherin的下调表达（P<0.05）,并逆转α-SMA和MMP-2、9上调表达（P<0.05）。结论：在肾小管上皮细胞中,TGF-β1诱导分泌MMP2/9,而LeftyA可拮抗此事件,减轻MMP-2/9对肾小管基底膜的损伤。LeftyA通过抑制TGF-β1经MMP-2/9介导的上皮肌成纤维母细胞转分化（EMT）,从而减轻肾纤维化,发挥抗纤维化作用。第三部分LeftyA拮抗TGF-β1诱导人肾小管上皮细胞分泌MMP-2/9机制探讨目的：探讨在人肾小管上皮细胞中LeftyA拮抗TGF-β1诱导分泌基质金属蛋白酶2/9的机制。方法：在HK-2细胞中分别稳定转染pcDNA3.str-TGF-β1与pcDNA3.str-TGF-β1+pcDNA3.1-Lefty A, Western blot分别检测3种细胞p-Smad3蛋白,p-JNK蛋白、p-ERK及p-p38MAPK蛋白表达的变化。结果：稳定转染pcDNA3.str-TGF-β1即可诱导p-Smad3、p-JNK、p-ERK以及p-p38MAPK蛋白激活表达。在稳定转染pcDNA3.str-TGF-β1的HK-2细胞系中,转染pcDNA3.1-LeftyA, Lefty A蛋白表达上调,抑制TGF-β1对Smad3、JNK、ERK与p38MAPK的激活。结论：在人肾小管上皮细胞中,LeftyA蛋白通过抑制Smad信号通路及JNK、ERK与p38MAPK信号通路拮抗TGF-β1诱导分泌基质金属蛋白酶2/9。
古艳婷[10]（2013）在《二氢生物蝶呤还原酶下调TGFβ1/Smad3信号传导通路参与糖尿病肾病发生发展的实验研究》文中指出背景：多项流行病学调查显示,糖尿病肾病（diabetic nephropathy, DN）已成为全球慢性肾脏病（chronic kidney disease, CKD）和终末期肾病（end-stage renal disease, ESRD）的主要构成原因。DN的发病机制复杂,仍未完全阐明,目前认为DN的发生与多元醇通路激活、氧化应激、血流动力学改变、多种细胞因子的异常表达及遗传等多种因素密切相关。其中转化生长因子（transforming growth factor betal, TGF-β1）的表达增多是DN发生发展的重要因素,它可以诱导系膜外基质增加以及氧化应激反应从而促进肾小球硬化和纤维化。而TGF-β1作用于效应细胞的信号转导主要是通过激活Smad3通路实现。课题组在前期差异蛋白质组学中发现,二氢生物喋呤还原酶（dihydropteridine reductase, QDPR）在自发性Ⅱ型糖尿病模型OLETF大鼠肾脏损害时,编码此蛋白的基因发生了点突变,QDPR的主要功能是促进四氢生物喋呤（tetrahydrobiopterin, BH4）再生,而BH4又是3种一氧化氮合酶（nitric oxide synthase, NOS）生成的辅助因子继而会影响一氧化氮的合成。一氧化氮（nitric oxide, NO）在体内有着广泛的生理作用,在糖尿病肾病发病过程中它参与了肾小球硬化和氧化应激状态的形成过程,机制与调节TGF β1的生成,舒张血管,降低氧化应激反应,抑制中性粒细胞NADPH氧化酶活性等有关。QDPR作为调节体内BH4水平的关键代谢酶,在DN发生发展中的作用尚未明确。目前还没有文献报道QDPR与DN发生发展之间的关系。本研究通过观察QDPR在糖尿病肾病大鼠中的表达水平,以及野生型和突变型QDPR对TGF β1/Smad3信号通路的影响,深入揭示了DN的发病机制,为探索药物的作用靶点提供线索,研究思路具有较强的新颖性。目的：探讨二氢生物喋呤还原酶（dihydropteridine reductase, QDPR）是否能通过TGF-β1/Smad3信号转导通路参与糖尿病肾病的发生发展过程,为进一步深入了解DN的发生发展过程并为其分子诊断和基因治疗提供新的科学依据。方法：1.QDPR在1型糖尿病肾病大鼠模型肾皮质中表达变化的研究本部分研究首先制备了链脲佐菌素腹腔注射合并单侧肾切除诱导的1型糖尿病肾病的动物模型,20周后将动物处死取肾皮质提取总RNA及蛋白,然后采用RT-PCR和Western blot方法检测正常Wistar大鼠以及模型组大鼠肾皮质QDPR的表达变化,此外我们还检测了正常组和模型组TGF-β1, Smad3和NOXs基因和蛋白水平的变化。2.野生型QDPR基因对TGF β1/Smad3信号通路的影响本部分研究通过构建野生型QDPR重组质粒并转染至细胞,观察了在QDPR高表达时TGF-β/Smad通路以及相关基因的变化,质粒构建的具体步骤如下：根据GeneBank中大鼠QDPR mRNA序列设计引物,上游引物引入EcoR V酶切位点,下游引物引入Xba I酶切位点,以正常LETO大鼠肾脏皮质cDNA为模板,采用高保真PCR试剂盒扩增野生型QDPR cDNA片段,对PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳进行分离,分离后克隆至pUM-T载体并测序,然后亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1/V5-His,酶切鉴定后测序,如果测序结果正确则证明QDPR/pcDNA3.1/V5-His （rQDPR）重组质粒构建成功。随后用磷酸钙共沉淀法瞬时转染HEK293T细胞建立QDPR高表达的细胞模型,以空载体（control vector）作为对照,转染72h后收集细胞上清和细胞蛋白,先用Western blot方法来验证融合蛋白在细胞中是否成功表达,再采用Western blot和RT-PCR技术检测当QDPR过表达时三种NOS, TGF-β/Smad通路,NADPH氧化酶各亚基的表达量,此外,用ELISA技术检测BH4在空载体和rQDPR组中的含量。另一方面,我们通过敲降实验观察了QDPR在低表达时TGF-p等基因的变化。具体步骤如下：我们首先将QDPR mRNA的序列给公司,随后吉玛公司设计了3种大鼠QDPR基因siRNA Oligo干扰序列,分别为QDPR1: GCCAGCGUGAUUGUUAAGATT UCUUAACAAUCACGCUGGCTT; QDPR2: CCAAAUCCAAGUCACUCUUTT AAGAGUGACUUGGAUUUGGTT; QDPR3: AGCCUUGCAGGGAAGAACATT UGUUCUUCCCUGCAAGGCUTT。每段序列加入150u1水配置成20uM的溶液,分别取4ug和野生型rQDPR重组质粒DNA共转染至293T细胞,48h后收集细胞上清以及细胞,检测TGF-β1以及NADPH氧化酶各亚基的含量。3.突变型QDPR对TGF-β1/Smad通路及自噬作用的影响本部分研究通过构建突变型QDPR重组质粒并转染至细胞,观察了在QDPR基因突变时TGF-β/Smad通路以及相关基因的变化,质粒构建的具体步骤如下：根据GeneBank中大鼠QDPR mRNA序列设计引物,上游引物引入EcoR V酶切位点,下游引物引入Xba I酶切位点,以OLETF2型糖尿病自发性大鼠的肾脏皮质cDNA为模板,采用高保真PCR试剂盒扩增突变型QDPR cDNA片段,对PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳进行分离,-20℃保存。用T4DNA连接酶连接目的片段与载体,构建QDPR （mut）/pcDNA3.1/V5-His（rQDPR（mut））重组质粒。随后用磷酸钙共沉淀法瞬时转染HEK293T细胞,实验分为空载体组（control vector）,野生型rQDPR组,和突变型rQDPR（mut）组,转染72h后收集细胞上清和细胞蛋白,先用Vestern blot方法来验证融合蛋白在细胞中是否能成功表达,再采用Western blot和RT-PCR技术研究野生型和突变型QDPR对三种NOS, TGF-β/Smad通路,NADPH氧化酶各亚基的影响,此外,用ELISA技术来检测三组中BH4的含量。此外,我们还将野生型和突变型重组质粒转染至细胞观察了QDPR对自噬相关基因的影响,具体实验步骤如下：将成功构建好的野生型和突变型QDPR重组质粒分别转染至正常培养的HEK293T细胞,研究分为空载体组（control vector）,野生型rQDPR组,和突变型rQDPR（mut）三组,转染72h后,采用RT-PCR及Western blot方法检测空载体组,野生型QDPR组和突变型QDPR组自噬相关基因LC3和Beclin1的表达量变化。结果：1. QDPR在STZ+单侧肾切诱导糖尿病大鼠肾脏的表达研究：造模成功后,即实验第0周模型组大鼠血糖与空白组相比显着升高（P<0.01）,在之后的第4,8,12,16,20周各时间点均与空白组有极显着差异,均为P<0.01；在尿蛋白方面我们发现与空白组比较,模型组尿蛋白在实验第20周时显着升高（P<0.01）。20周龄Wistar大鼠以及单侧肾切除合并链脲佐菌素腹腔注射诱导的1型DN大鼠肾皮质与正常Wistar大鼠相比QDPR的mRNA及蛋白的水平都有所降低,TGF-β1,Smad3和NADPH氧化酶亚基的基因和蛋白水平都有所升高,提示在糖尿病肾病状态下QDPR的功能受损并影响了下游的一些蛋白和基因的表达。2.野生型QDPR对TGF β1/Smad3信号通路的影响：酶切和测序结果都显示QDPR的cDNA序列正确,测序正确后将构建好的重组质粒转染至293T细胞后,发现融合蛋白在细胞中能成功表达,并旦与空载体对照组相比,QDPR高表达组TGF-β1和smad3的基因和蛋白水平以及NADPH氧化酶亚基NoX1, NOX4的表达都有所降低,而nNOS的基因水平与BH4的含量在QDPR高表达时有所升高,初步推测QDPR的高表达影响了这些蛋白和基因的变化。此外,将设计的三对siRNA序列与野生型QDPR重组质粒DNA共转染至293T细胞中,Western blot结果显示有一条siRNA序列的基因敲除率达80%,可用于下一步研究,在随后的结果中我们发现,QDPR基因被敲除后,TGF-β1的表达相应升高,以及NOX1, NOX4的表达都有所升高。RNAi结果更证实了QDPR基因有下调TGF-β1表达的功能。3.突变型QDPR对TGF-β1/Smad通路及自噬作用的影响：在质粒构建中,测序结果显示突变型QDPR的cDNA序列与基因组的序列对比在93位氨基酸的位置突变,测序后将构建好的重组质粒转染至293T细胞后,发现融合蛋白在细胞中能成功表达,表明我们成功构建了突变型QDPR重组质粒,在进一步的检测中我们发现,与野生型QDPR重组质粒组相比,QDPR基因点突变后TGF-β1和Smad3的基因和蛋白水平以及NADPH氧化酶亚基的表达都明显增加,而nNOS的基因水平与BH4的含量却没有明显变化。此外,突变型研究中我们还描述了QDPR基因突变后对HEK293T细胞自噬相关基因的影响。RT-PCR结果显示,与空载体组相比,野生型QDPR组LC3基因水平明显上调（P<0.05）,突变型QDPR组LC3基因水平与空载体组相比无统计学差异；与空载体组相比,野生型和突变型Beclinl基因水平无统计学差异；Vestern blot结果显示,与空载体组相比,野生型QDPR组LC3-II和Beclinl的蛋白表达量明显上调（P<0.05）,而LC3-I的蛋白表达量无统计学差异。结论：1. QDPR的表达量在I型糖尿病肾病大鼠的肾皮质明显降低,提示糖尿病肾病的发生影响了QDPR的功能,由此我们推测QDPR可能参与了糖尿病肾病的发病过程并在其中有重要作用。2.野生型QDPR重组质粒细胞实验结果显示QDPR蛋白可以通过影响BH4来调节TGF-β1/Smad通路的变化。对于QDPR基因功能的深入研究将有助于揭示DN肾小球硬化的分子生物学机制,为研究糖尿病肾病的发病机制研究提供新的思路。3.突变型QDPR重组质粒细胞实验结果显示QDPR基因的点突变没有影响QDPR在BH4再生循环中的作用,但基因点突变后QDPR的结构有可能发生了变化,并通过调节其他途径影响了TGF-β1/Smad3通路,由此可见QDPR基因点突变对于QDPR调节TGF-β1/Smad3通路的功能有重要作用,这值得我们围绕QDPR的结构和功能做进一步研究。我们还发现突变型QDPR重组质粒能激活HEK293T细胞的自噬作用,激活过程可能和自噬相关基因的表达增强有关。
二、大鼠肾脏系膜细胞转染人TGF-β1基因可增强MMP-2表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、大鼠肾脏系膜细胞转染人TGF-β1基因可增强MMP-2表达（论文提纲范文）
（1）基于miR-218/GPRC5A通路探讨补阳还五汤干预糖尿病肾损伤的机制研究（论文提纲范文）
| 提要 |
| abstract |
| 主要英文缩略词表 |
| 第一部分 MIR-218/GPRC5A通路在高糖诱导HK-2细胞损伤中的作用机制 |
| 引言 |
| 第一章 生信分析 |
| 材料与方法 |
| 1差异基因分析:GEO数据集GSE114477(miRNA) |
| 2 MIR-218靶基因预测 |
| 3 GPRC5A差异表达分析 |
| 第二章 miR-218/GPRC5A对高糖诱导HK-2的作用及机制探讨 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞系 |
| 1.2 主要材料与试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 主要溶液试剂的配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 HK-2细胞株复苏 |
| 2.2 细跑传代 |
| 2.3 细跑冻存 |
| 2.4 细胞静止 |
| 2.5 细胞分组 |
| 2.6 细胞转染 |
| 3 实时荧光定量PCR(qRT-PCR) |
| 3.1 全RNA提取 |
| 3.2 逆转录合成cDNA |
| 3.3 PCR扩增 |
| 4 蛋白质印迹法 |
| 4.1 总蛋白提取 |
| 4.2 BCA法测定细胞蛋白浓度 |
| 4.3 Western blot |
| 5 CCK-8(CELL COUNTING KIT-8)检测 |
| 6 ANNEXIN V/FITC凋亡检测 |
| 7 LUCIFERASE ASSAY荧光素酶报告检测 |
| 7.1 pMIR-REPORT载体 |
| 7.2 实验分组 |
| 7.3 细胞转染 |
| 7.4 Luciferase荧光测定 |
| 8 统计分析 |
| 9 结果 |
| 9.1 miR-218在Con、NG、HG组 HK-2中的表达情况 |
| 9.2 炎性因子在Con、NG、HG组 HK-2中的表达情况 |
| 9.3 miR-218对高糖条件下肾小管细胞功能的影响 |
| 9.4 miR-218直接靶向GPRC5A的验证 |
| 9.5 miR-218/GPRC5A对 HG下 HK-2细胞功能的影响。 |
| 讨论 |
| 第二部分 补阳还五汤调控miR-218/GPRC5A通路改善db/db小鼠肾损伤研究 |
| 引言 |
| 第一章 补阳还五汤对db/db小鼠肾脏保护作用 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂及药品 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 实验主要试剂的配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 实验用药 |
| 2.3 实验动物分组与给药 |
| 2.4 标本收集与处理 |
| 2.5 指标观察及检测 |
| 2.6 肾组织石蜡切片制备 |
| 2.7 肾组织病理染色 |
| 2.8 显微镜下观察肾脏组织形态变化 |
| 3 统计方法 |
| 4 结果 |
| 4.1 各组小鼠一般情况观察 |
| 4.2 各组小鼠体重变化 |
| 4.3 各组小鼠血糖(BS)情况 |
| 4.4 各组小鼠尿蛋白排泄率(UAE)变化 |
| 4.5 各组小鼠肾功能变化 |
| 4.6 各组小鼠肾脏病理结果 |
| 第二章 补阳还五汤对MIR-218/GPRC5A通路的调控作用 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 造模及分组:同第一章 |
| 2.2 实时荧光定量PCR反应(q RT-PCR) |
| 2.3 免疫印迹法 |
| 3 统计分析 |
| 4 结果 |
| 4.1 各组小鼠肾组织中miR-218的表达情况 |
| 4.2 Western blot检测GRPC5A、a-SMA、Vimentin、Col-1蛋白的表达 |
| 4.3 Western blot检测凋亡蛋白及炎症因子蛋白的表达 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 综述 MicroRNAs在糖尿病肾病中的研究概况 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 查新报告 |
| 发表论文 |
| 科研课题 |
（2）芪黄四物汤通过调控miRNA-mRNA共表达网络改善肾脏纤维化的机制研究（论文提纲范文）
| 提要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 理论探讨 |
| 1.祖国医学对CKD与RF的认识 |
| 1.1 历代经典中CKD与RF的论述 |
| 1.2 现代医家对CKD与RF的认识 |
| 2.西方医学对RF的认识 |
| 2.1 ECM受体相互作用与RF |
| 2.2 TGF-β/SMAD通路与RF |
| 2.3 内质网应激与RF |
| 2.4 氧化应激与RF |
| 2.5 微炎症与RF |
| 2.6 脂肪酸代谢与RF |
| 2.7 肾小管上皮细胞EMT与RF |
| 2.8 MiRNA与 RF |
| 第二部分 临床研究 |
| 1 研究目的 |
| 2 研究对象及来源 |
| 3 CKD诊断及分期标准 |
| 3.1 CKD诊断标准 |
| 3.2 CKD分期标准 |
| 4 中医辨证标准 |
| 5 病例选择标准 |
| 5.1 纳入标准 |
| 5.2 排除标准 |
| 5.3 脱落标准 |
| 6 研究设计 |
| 6.1 样本量估计 |
| 6.2 试验分组 |
| 6.3 治疗方案 |
| 6.4 治疗疗程 |
| 6.5 观察指标及方法 |
| 7 疗效评定标准 |
| 7.1 临床总疗效评定标准 |
| 7.2 中医证候疗效评定标准 |
| 7.3 安全性评定标准 |
| 8 统计学方法 |
| 9 试验结果 |
| 9.1 两组患者性别、年龄、病程比较 |
| 9.2 两组患者原发病、CKD分期比较 |
| 9.3 两组患者Scr、BUN、UA及 eGFR比较 |
| 9.4 两组患者UACR、β2-MG及 NAG比较 |
| 9.5 两组患者HGB、血钙、血磷及PTH比较 |
| 9.6 两组患者血清TGF-β1、SOD及 IL-6比较 |
| 9.7 两组患者中医证候积分的比较 |
| 9.8 两组患者中医证候疗效的比较 |
| 9.9 两组患者临床总疗效的比较 |
| 9.10 安全性指标分析 |
| 第三部分 动物实验 |
| 实验一 芪黄四物汤对环孢素A(CsA)诱导的肾脏纤维化(RF)小鼠的肾脏保护作用 |
| 1 实验目的 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 药品与试剂 |
| 2.3 仪器及耗材 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 动物分组及给药 |
| 3.2 样品收集与准备 |
| 3.3 一般情况、肾功能、炎症及氧化应激相关代谢物的测定 |
| 3.4 HE染色 |
| 3.5 Masson染色 |
| 3.6 PAS染色 |
| 3.7 TUNEL凋亡实验 |
| 3.8 统计学方法 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 芪黄四物汤对小鼠一般情况、体质量及24h尿量的影响 |
| 4.2 芪黄四物汤对小鼠血清Scr、BUN、UA的影响 |
| 4.3 芪黄四物汤对小鼠尿液UACR、NAG的影响 |
| 4.4 芪黄四物汤对小鼠血清IL-6、MDA的影响 |
| 4.5 芪黄四物汤对小鼠肾组织病理的影响 |
| 4.6 芪黄四物汤对小鼠肾组织细胞凋亡的影响。 |
| 实验二 芪黄四物汤对RF小鼠miRNA-mRNA共表达网络的调控作用 |
| 1 实验目的 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 药品与试剂 |
| 2.2 仪器及耗材 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 miRNA与 mRNA测序 |
| 3.2 DE mRNAs和 DE miRNAs的关联分析 |
| 3.3 靶miRNA的 qRT-PCR验证 |
| 3.4 靶mRNA的 qRT-PCR验证 |
| 3.5 Western Blot |
| 3.6 免疫荧光 |
| 3.7 肾组织ELISA |
| 3.8 统计学分析 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 差异miRNAs的筛选及芪黄四物汤的干预作用 |
| 4.2 芪黄四物汤调控的靶miRNAs的筛选 |
| 4.3 芪黄四物汤调控的靶miRNAs的 qRT-PCR验证 |
| 4.4 差异mRNAs的筛选及芪黄四物汤的干预作用 |
| 4.5 DE miRNAs和 DE mRNAs共表达网络的构建 |
| 4.6 DE miRNAs-DE mRNAs共表达基因的KEGG富集 |
| 4.7 芪黄四物汤调控ECM-receptor interaction通路改善RF |
| 4.8 芪黄四物汤通过调控CD44、MMP2、SPP1改善RF |
| 4.9 芪黄四物汤通过调控TGF-beta signaling pathway改善RF |
| 4.10 芪黄四物汤通过调控内质网应激(ERS)改善RF |
| 4.11 芪黄四物汤通过调控脂肪酸代谢改善RF |
| 4.12 芪黄四物汤通过调控线粒体氧化应激改善RF |
| 第四部分 细胞实验 芪黄四物汤通过miR-21-5p/SMAD7轴对CsA诱导的人肾小管上皮细胞(HKC)上皮间充质转分化(EMT)的影响 |
| 1 实验目的 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 细胞株 |
| 2.2 药品与试剂 |
| 2.3 仪器与耗材 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 细胞培养 |
| 3.2 实验用药物和试剂的配制 |
| 3.3 细胞增殖功能检测(MTT) |
| 3.4 细胞凋亡实验 |
| 3.5 Transwell细胞迁移功能检测 |
| 3.6 mRNA的 qRT-PCR检测 |
| 3.7 miRNA的 qRT-PCR检测 |
| 3.8 Western Blot |
| 3.9 细胞转染 |
| 3.10 统计学方法 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 CsA对 HKC增殖的影响及芪黄四物汤的调控作用 |
| 4.2 芪黄四物汤对CsA诱导的HKC凋亡的影响 |
| 4.3 芪黄四物汤对CsA诱导的HKC迁移的影响 |
| 4.4 芪黄四物汤对CsA诱导的HKC E-cadherin、a-SMA表达的影响 |
| 4.5 芪黄四物汤对CsA诱导的HKC TGF-β1、SMAD3、SMAD7表达的影响 |
| 4.6 芪黄四物汤对CsA诱导的HKC miR-21-5p、miR-375-3p、miR-802表达的影响 |
| 4.7 芪黄四物汤通过调控miR-21-5p对 CsA诱导的HKC SMAD7、a-SMA、E-cadherin的影响 |
| 4.8 芪黄四物汤调控miR-21-5p对 CsA诱导的HKC迁移的影响 |
| 讨论 |
| 1 导师对CKD与RF病因病机的认识 |
| 1.1 脾肾亏虚乃CKD与RF发生的基础 |
| 1.2 血瘀贯穿CKD及RF的始终 |
| 1.3 湿热浊毒是CKD与RF的重要环节 |
| 2 芪黄四物汤的立法组方及药理分析 |
| 2.1 导师治疗CKD立法组方的思路 |
| 2.2 芪黄四物汤的组成及配伍分析 |
| 2.3 芪黄四物汤各单味药抗RF的现代药理研究 |
| 3 临床研究分析 |
| 3.1 芪黄四物汤改善肾功能、肾小球及肾小管-间质损伤 |
| 3.2 芪黄四物汤改善肾性贫血、钙磷代谢紊乱及PTH |
| 3.3 芪黄四物汤改善机体纤维化、氧化应激及微炎症状态 |
| 3.4 芪黄四物汤改善中医证候积分、中医证候疗效及临床总疗效 |
| 3.5 芪黄四物汤治疗CKD安全有效 |
| 4 动物实验分析 |
| 4.1 RF动物实验模型的选择 |
| 4.2 芪黄四物汤改善肾脏病理损伤及肾功能 |
| 4.3 芪黄四物汤调控紊乱的miRNA-mRNA共表达网络改善RF |
| 5 细胞实验分析 |
| 5.1 芪黄四物汤可有效抑制EMT |
| 5.2 芪黄四物汤可能通过调控miR-21-5p/SMAD7轴抑制EMT |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 综述 miR-21、miR-29与肾脏纤维化关系的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 查新报告 |
| 论文着作 |
| 附件 |
（3）间充质干细胞对2型糖尿病肾脏保护作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 糖尿病肾病的发病机制 |
| 1.1.1 血流动力学改变 |
| 1.1.2 代谢紊乱 |
| 1.1.3 糖尿病肾病与氧化损伤 |
| 1.1.4 糖尿病肾病与炎症 |
| 1.1.5 糖尿病肾病与纤维化 |
| 1.1.6 糖尿病肾病与细胞凋亡 |
| 1.2 Nrf2 与糖尿病肾病 |
| 1.3 MSCS对糖尿病肾脏保护作用研究进展 |
| 1.3.1 MSCs直接分化为受损伤的组织细胞 |
| 1.3.2 MSCs通过旁分泌机制改善肾损伤 |
| 1.3.3 MSCs治疗糖尿病肾病的临床研究 |
| 1.3.4 MSCs治疗糖尿病肾病的展望 |
| 第2章 HUCMSCS对糖尿病大鼠肾脏的保护作用 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 仪器设备 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要抗体 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 HUCMSCs的制备、培养及鉴定 |
| 2.2.2 2 型糖尿病大鼠模型的建立 |
| 2.2.3 实验分组及处理 |
| 2.2.4 血液、尿液及组织标本的收集 |
| 2.2.5 大鼠生化指标检测 |
| 2.2.6 PAS、Masson染色 |
| 2.2.7 免疫组化 |
| 2.2.8 肾组织透射电镜标本制备 |
| 2.2.9 TUNEL染色 |
| 2.2.10 蛋白免疫印迹法(western blot) |
| 2.2.11 实时定量聚合酶链式反应(RT-qPCR) |
| 2.2.12 统计方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 HUCMSCs对大鼠生理、生化指标的影响 |
| 2.3.2 HUCMSCs对糖尿病大鼠肾脏形态学改变的影响 |
| 2.3.3 HUCMSCs对糖尿病大鼠肾脏氧化损伤的影响 |
| 2.3.4 HUCMSCs对糖尿病大鼠肾脏炎症反应的影响 |
| 2.3.5 HUCMSCs对糖尿病大鼠肾脏细胞凋亡的影响 |
| 2.3.6 HUCMSCs对糖尿病大鼠肾脏纤维化的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第3章 HUCMSCS对高糖高脂刺激的肾小球系膜细胞的保护作用 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验细胞 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要试剂配制 |
| 3.1.4 主要仪器设备及耗材 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 人肾小球系膜细胞培养,传代,冻存及复苏 |
| 3.2.2 HUCMSCs的培养,传代,冻存及复苏 |
| 3.2.3 HUCMSCs与肾小球系膜细胞共培养体系的构建 |
| 3.2.4 细胞增殖水平测定 |
| 3.2.5 Western blot检测相关蛋白的表达 |
| 3.2.6 免疫荧光检测系膜细胞Nrf2 的表达 |
| 3.2.7 统计方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 建立高糖高脂刺激的肾小球系膜细胞模型 |
| 3.3.2 h UCMSCs与肾小球系膜细胞共培养体系的构建 |
| 3.3.3 细胞实验分组的确定 |
| 3.3.4 HUCMSCs对高糖高脂刺激的肾小球系膜细胞形态的影响 |
| 3.3.5 HUCMSCs对肾小球系膜细胞氧化损伤的影响 |
| 3.3.6 HUCMSCs对肾小球系膜细胞凋亡的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第4章 HUCMSCS对2 型糖尿病肾脏保护作用机制研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 实验细胞 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 实验药物及抗体 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 肾组织核蛋白、浆蛋白的提取 |
| 4.2.2 Nrf2 siRNA干扰 |
| 4.2.3 统计方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 HUCMSCs对糖尿病大鼠Nrf2 及其下游因子的影响 |
| 4.3.2 HUCMSCs对系膜细胞Nrf2 及其下游因子的影响 |
| 4.3.3 HUCMSCs激活Nrf2 的方式 |
| 4.3.4 Nrf2是hUCMSCs保护糖尿病肾病的关键因子 |
| 4.3.5 HUCMSCs激活Nrf2上游PI3K/AKT/mTOR信号通路 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 结论 |
| 第5章 结论与课题创新性 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 课题创新性 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（4）E3泛素连接酶TRIM31在高血压肾病中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 第一部分: E3泛素连接酶TRIM31调控高血压肾病发生的实验研究 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语说明 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 附表 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分: E3泛素连接酶TRIM31改善高血压肾病的分子机制研究 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语说明 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文Ⅰ |
| 外文论文Ⅱ |
（5）肾康注射液调节UUO小鼠肾纤维化及HUVEC血管生成的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 文献综述 |
| 综述一 中医药防治慢性肾脏病肾纤维化研究进展 |
| 1. 病名 |
| 2. 病因病机 |
| 3. 临床治疗 |
| 4. 实验研究 |
| 参考文献 |
| 综述二 肾康注射液治疗肾脏疾病研究概述 |
| 1. 药物基本情况 |
| 2. 临床疗效研究 |
| 3. 基础药理机制研究 |
| 4.发展前景 |
| 参考文献 |
| 综述三 血管生成在肾纤维化发生发展中作用的研究进展 |
| 1. 血管生成发生发展 |
| 2. 肾纤维化发生发展 |
| 3. 血管生成障碍与肾纤维化密切相关 |
| 参考文献 |
| 实验研究 |
| 前言 |
| 实验一 肾康注射液对UUO小鼠肾纤维化和血管生成的影响 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 实验二 肾康注射液对HUVEC血管生成和VEGF/VEGFR-2/eNOS的影响 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 创新点 |
| 不足与展望 |
| 致谢 |
| 在学期间主要成果 |
（6）益肾活血方颗粒抗大鼠早期糖尿病肾病作用及机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 绪论 |
| 第一篇 益肾活血方颗粒对大鼠早期DN影响的研究 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 DM损伤肾脏固有细胞的研究进展 |
| 1.1.1 肾小球系膜细胞与DM |
| 1.1.2 肾小球毛细血管内皮细胞与DM |
| 1.1.3 肾小球毛细血管上皮细胞(足细胞)与DM |
| 1.1.4 肾小管上皮细胞与DM |
| 1.1.5 肾间质成纤维细胞与DM |
| 1.2 DN发病机制的研究进展 |
| 1.2.1 氧化应激损伤与DN |
| 1.2.2 TGF-β1/Smads信号通路与DN |
| 1.2.3 遗传易感性与DN |
| 1.3 中药治疗DN的研究进展 |
| 1.3.1 中医对DN发病机制的认识 |
| 1.3.2 中药治疗DN的研究进展 |
| 1.3.3 益肾活血方颗粒组方分析 |
| 2 实验部分 |
| 2.1 益肾活血方颗粒抗大鼠早期DN药效作用的研究 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 益肾活血方颗粒抗大鼠早期DN作用机制的研究 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 3 实验结果与讨论 |
| 3.1 益肾活血方颗粒抗大鼠早期DN药效作用的研究 |
| 3.1.1 益肾活血方颗粒对早期DN大鼠一般状况的影响 |
| 3.1.2 益肾活血方颗粒对早期DN大鼠血糖的影响 |
| 3.1.3 益肾活血方颗粒对早期DN大鼠肾脏功能的影响 |
| 3.1.4 益肾活血方颗粒对早期DN大鼠肾脏病理的影响 |
| 3.2 益肾活血方颗粒抗大鼠早期DN作用机制的研究 |
| 3.2.1 益肾活血方颗粒对早期DN大鼠氧化应激水平的影响 |
| 3.2.2 益肾活血方颗粒对早期DN大鼠TGF-β1/Smads信号传导通路的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第二篇 益肾活血方颗粒主要有效成分的筛选与测定 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 人参皂苷Rg1 药代动力学的研究进展 |
| 1.2 黄芪甲苷药代动力学的研究进展 |
| 2 实验部分 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 实验结果与讨论 |
| 3.1 高效液相色谱-质谱联用(LC-MS)方法学考察 |
| 3.2 益肾活血方中Rg1和AS-Ⅳ含量的测定 |
| 3.3 大鼠血清中Rg1和AS-Ⅳ血药浓度的测定 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第三篇 人参皂苷Rg1 联合黄芪甲苷抗大鼠早期DN的作用及机制 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 Rg1 药理活性的研究进展 |
| 1.1.1 促进细胞增殖 |
| 1.1.2 抗炎症损伤 |
| 1.1.3 抗氧化应激 |
| 1.1.4 抗细胞凋亡 |
| 1.2 AS-Ⅳ药理活性的研究进展 |
| 1.2.1 抗肾脏纤维化 |
| 1.2.2 抗氧化应激 |
| 1.2.3 抗病毒 |
| 2 实验部分 |
| 2.1 Rg1+AS-Ⅳ抗大鼠早期DN作用的研究 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 Rg1+AS-Ⅳ抗大鼠早期DN作用机制的研究 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 3 实验结果与讨论 |
| 3.1 Rg1+AS-Ⅳ抗大鼠早期DN作用的研究 |
| 3.1.1 Rg1+AS-Ⅳ对早期DN大鼠一般状况的影响 |
| 3.1.2 Rg1+AS-Ⅳ对早期DN大鼠血糖的影响 |
| 3.1.3 Rg1+AS-Ⅳ对早期DN大鼠肾脏功能的影响 |
| 3.1.4 Rg1+AS-Ⅳ对早期DN大鼠肾脏组织病理的影响 |
| 3.2 Rg1+AS-Ⅳ抗大鼠早期DN作用机制的研究 |
| 3.2.1 Rg1+AS-Ⅳ对早期DN大鼠氧化应激水平的影响 |
| 3.2.2 Rg1+AS-Ⅳ对早期DN大鼠TGF-β1/Smads信号传导通路的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 结论与展望 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间取得科研成果 |
| 致谢 |
（7）周细胞对脓毒症大鼠血管舒缩和屏障功能的协同保护作用及机制（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 周细胞对脓毒症大鼠血管舒缩和屏障功能的协同保护作用及机制 |
| 2.1 材料和实验方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 白藜芦醇对脓毒症大鼠血管舒张功能的保护作用及机制 |
| 3.1 材料和实验方法 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 周细胞在血管相关疾病中的作用及调控研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（8）CCN3对TGF-β1诱导的人肾小球系膜细胞胞外基质代谢的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词 |
| 前言 |
| 文献综述 CCN3与纤维化 |
| 第一部分 外源性CCN3对TGF-β1诱导的人肾小球系膜细胞胞外基质代谢的影响 |
| 实验材料和方法 |
| 研究内容 |
| 研究结果 |
| 第二部分 内源性CCN3对TGF-β1诱导的人肾小球系膜细胞胞外基质代谢的影响 |
| 实验材料和方法 |
| 研究内容 |
| 研究结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
（9）LeftyA拮抗TGF-β1诱导肾小管上皮细胞分泌基质金属蛋白酶对肾纤维化的影响及机制（论文提纲范文）
| 论文创新点 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分 人TGF-β1基因转染诱导的HK-2细胞MMP-2/9表达变化 |
| 第二部分 LeftyA拮抗TGF-β1诱导人肾小管上皮细胞分泌MMP-2/9对肾纤维化的影响 |
| 第三部分 LeftyA拮抗TGF-β1诱导人肾小管上皮细胞分泌MMP-2/9机制探讨 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（10）二氢生物蝶呤还原酶下调TGFβ1/Smad3信号传导通路参与糖尿病肾病发生发展的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 QDPR在糖尿病肾病大鼠模型中的表达研究 |
| (一) 材料和方法 |
| (二) 结果 |
| (三) 讨论 |
| 第二部分 野生型QDPR对TGF-B1/SMAD3信号通路的影响 |
| 第一节 野生型QDPR高表达对TGF-B1/SMAD3信号通路的影响 |
| (一) 材料与方法 |
| (二) 结果 |
| (三) 讨论 |
| 第二节 野生型QDPR基因敲除后对TGF-B1/SMAD3信号通路的影响 |
| (一) 材料和方法 |
| (二) 结果 |
| (三) 讨论 |
| 第三部分 突变型QDPR对TGF-B1/SMAD3信号通路和自噬作用的影响 |
| 第一节 突变型QDPR基因对TGF-B1/SMAD3信号通路的影响 |
| (一) 材料和方法 |
| (二) 结果 |
| (三) 讨论 |
| 第二节 QDPR基因参与调控HEK293T细胞自噬作用的研究 |
| (一) 材料和方法 |
| (二) 结果 |
| (三) 讨论 |
| 第四部分 小结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| NO/NOS系统与糖尿病肾病关系的研究进展 |
| 参考文献 |
| TGF-B1/SMADS信号通路与糖尿病肾病新进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 图版 |
四、大鼠肾脏系膜细胞转染人TGF-β1基因可增强MMP-2表达（论文参考文献）
- [1]基于miR-218/GPRC5A通路探讨补阳还五汤干预糖尿病肾损伤的机制研究[D]. 苏珊珊. 山东中医药大学, 2021
- [2]芪黄四物汤通过调控miRNA-mRNA共表达网络改善肾脏纤维化的机制研究[D]. 韩聪. 山东中医药大学, 2021
- [3]间充质干细胞对2型糖尿病肾脏保护作用及机制研究[D]. 聂萍. 吉林大学, 2021(01)
- [4]E3泛素连接酶TRIM31在高血压肾病中的作用及机制研究[D]. 张杰. 山东大学, 2021
- [5]肾康注射液调节UUO小鼠肾纤维化及HUVEC血管生成的机制研究[D]. 潘雅婧. 北京中医药大学, 2020(04)
- [6]益肾活血方颗粒抗大鼠早期糖尿病肾病作用及机制的研究[D]. 杜娜. 吉林大学, 2019(02)
- [7]周细胞对脓毒症大鼠血管舒缩和屏障功能的协同保护作用及机制[D]. 张紫森. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019(03)
- [8]CCN3对TGF-β1诱导的人肾小球系膜细胞胞外基质代谢的影响[D]. 刘海飞. 东南大学, 2016(03)
- [9]LeftyA拮抗TGF-β1诱导肾小管上皮细胞分泌基质金属蛋白酶对肾纤维化的影响及机制[D]. 郑壬平. 武汉大学, 2014(02)
- [10]二氢生物蝶呤还原酶下调TGFβ1/Smad3信号传导通路参与糖尿病肾病发生发展的实验研究[D]. 古艳婷. 北京协和医学院, 2013(05)