一、DNA测序、PCR-SSCP和phaB间接药敏实验检测结核分枝杆菌利福平耐药性的比较（论文文献综述）
杨彩虹,杨敏,于璐,包海洋,吴长新,曹旭东,陈创夫[1]（2017）在《高分辨率熔解曲线技术用于结核分枝杆菌临床分离株异烟肼耐药性的快速检测》文中研究说明目的评价高分辨率熔解曲线分析技术（high-resolution melting curve,HRM）检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性的应用价值。方法 1)通过传统比例法药敏实验对本实验室保存的49株结核分枝杆菌进行异烟肼耐药性分析。2)进一步对该结核分枝杆菌进行异烟肼耐药相关基因KatG基因和inhA基因进行异烟肼耐药决定区测序分析,筛查突变位点。3)根据筛查到的突变位点设计高分辨率熔解曲线分析所用的特异性引物,对异烟肼耐药基因耐药决定区进行高分辨率熔解曲线分析检测DNA突变,评估用高分辨率熔解曲线分析技术对结核分枝杆菌异烟肼耐药性检测的效率。结果 1)比例法药敏结果显示,49株实验菌株中20株为异烟肼耐药株,29株为异烟肼敏感株。2)测序分析结果显示:（1）KatG基因出现了4种突变形式,分别是234单位点突变;234、315双位点突变;234、463双位点突变;234、315、463三位点联合突变。（2）inhA基因检测到3种突变,即-8位、-15位、-152位。3)（1）对耐药株的基因突变进行分析发现:20株异烟肼耐药株中11株存在KatG基因第315位密码子的突变、占异烟肼耐药株的55%;6株存在inhA基因-15（4株）位碱基、-8（1株）位碱基、-152（1株）位碱基的突变,共占异烟肼耐药株的30%;2株同时存在基因KatG315密码子和inhA-15位碱基的突变,占异烟肼耐药株的10%;1株均未检测到KatG基因和inhA基因的突变,占异烟肼耐药株的5%。通过基因突变检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性的敏感性为95%、特异性为100%。（2）用高分辨率溶解曲线检测实验菌株耐药基因突变的结果显示,18株存在基因突变,24株不存在基因突变,检测的灵敏度为94.7%、特异性为80%。（3）以高分辨率熔解曲线检测到突变为耐药的判断标准,检出19株为耐药株,24株为敏感株。以比例法药敏结果为参照,检测的灵敏度为95%、特异性为82.76%。结论高分辨率溶解曲线用于结核分枝杆菌对异烟肼耐药性的检测具有较好的灵敏度,耗时短,在异烟肼耐药结核病的快速诊断方面具有一定的应用价值。
胡晓红,向启云,庄倩,李沫,董艳娥[2]（2015）在《基因芯片法检测结核分枝杆菌耐药性的可行性分析》文中研究说明目的分析基因芯片法检测结核分枝杆菌（MTB）耐药性的灵敏度、特异度及符合率,为临床提供方便、准确、快速的MTB耐药性的检测方法。方法以DNA测序法为金标准,采用基因芯片法与比例法药敏试验同时对2014年812月收治的250例结核病患者的痰液标本分离MTB菌株进行耐药性检测,比较两种方法检测MTB对利福平和异烟肼耐药性的效能。结果基因芯片法与比例法药敏试验检测MTB对利福平的耐药率分别为3.0%、3.5%,对异烟肼的耐药率分别为6.7%、8.2%。以DNA测序法为金标准,基因芯片法检测MTB对利福平与异烟肼耐药性的灵敏度、特异度及符合率均高于比例法药敏试验,且检测时间短于比例法药敏试验,差异均有统计学意义（P<0.05）。结论运用基因芯片法检测MTB对利福平和异烟肼的耐药性,具有较高的灵敏度、特异度与符合率,可以代替比例法药敏试验成为检测MTB耐药性的有效方法。
陈燕[3]（2014）在《中国结核菌耐多药和广泛耐药相关基因突变特征及MAS-PCR研究》文中研究表明目的：分析中国耐多药（MDR‐TB）和广泛耐药结核分枝杆菌（XDR‐TB）耐药相关基因的突变特征；建立与之相应的等位基因特异性多重聚合酶链反应（multiplex allele‐specific PCR，MAS‐PCR）技术，以实现对MDR‐TB与XDR‐TB的快速检测，为MDR‐TB与XDR‐TB的诊断和监测提供新的技术手段。材料和方法：1.采用比例法药敏试验，从全国23省收集的结核分枝杆菌菌株中筛选了230株MDR‐TB，27株XDR‐TB及64株敏感菌株用于本研究。研究菌株由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所结核病实验室收集保藏并提供。2.采用L-J培养基培养菌株，并通过CTAB（溴化十六烷基三甲铵）法提取全基因组DNA用于耐药相关基因的聚合酶链反应（PCR）扩增，PCR产物采用脱氧核糖核酸（DNA）测序分析。3.利用基因测序技术，分别对321株试验菌株的katG基因，inhA调控区，ahpC－oxyR基因间隔区，rpoB基因，gyrA, gyrB基因及rrs基因进行序列分析。4.根据我国MDR‐TB及XDR‐TB耐药相关基因的突变特点，筛选与耐药高度相关的基因突变位点，建立与之相应的MAS‐PCR检测技术，对MDR‐TB及XDR‐TB进行快速检测。5．利用MAS‐PCR技术对湖南省200株结核分枝杆菌临床分离株（含MDR‐TB，XDR‐TB，敏感菌株）进行检测验证，并与传统比例法药敏试验结果进行比较，评价MAS‐PCR技术的实用性。结果：1.257株耐多药和广泛耐药结核分枝杆菌中，14.0%的菌株inhA基因发生突变，58.4%菌株的katG基因发生突变，16.7%菌株的oxyR-ahpC基因发生突变，同时考虑这三种基因，异烟肼耐药相关基因突变检出率可达79.8%；91.1%菌株的rpoB基因发生突变，67.1%菌株的gyrA基因发生突变，7.6%菌株的gyrB基因发生突变，40.0%菌株的rrs基因发生突变。基因突变的主要位点为katG315（49.8%），inhA-15（9.4%），rpoB531（49.8%），526（22.6%）和516（10.5%），gyrA94（43.0%）和90（21.5%），rrs1401（40%）。2.根据我国MDR‐TB及XDR‐TB耐药相关基因的特点，建立了与之相应的MAS‐PCR耐药检测技术。对200株临床分离株（43株MDR，其中4株XDR）进行了MAS-PCR检测。MAS-PCR与比例法药敏试验比较，异烟肼耐药检测的敏感性为72.5%（50/69），对利福平检测的敏感性为77.0%（40/52），检测氧氟沙星敏感性为66.7%（14/21），而卡那霉素为75%（3/4），四种药物检测的特异性均为100%。结论：1.我国耐多药结核菌异烟肼、利福平、氧氟沙星和卡那霉素耐药相关基因最常见突变为katG315、inhA-15，rpoB531、526和516, gyrA94和90，rrs1401。2. MAS-PCR技术检测MDR-及XDR-TB耐药性简便、快速、特异性高，对MDR-及XDR-TB耐药早期诊断具有重要意义。
米贤文[4]（2013）在《新型噬菌体压电传感器快速检测结核分枝杆菌的机理及其药敏应用效果的研究》文中认为结核病是目前单因素引起发病率和死亡率最高的疾病。全球有三分之一的人群感染结核分枝杆菌，每年新增800万结核病人，有200万人死于结核病。世界卫生组织于1993年宣布：全球处于结核病紧急状态。引起结核病再次大流行的原因之一是不合理用药导致的耐药菌株的出现。为有效执行DOTS（Directly ObservedTreatment, Short-Course）策略，快速检测结核分枝杆菌和正确选择抗生素治疗成为防治结核病的关键。利用串联式压电石英传感器对环境电参数响应灵敏的特点，将其应用于微生物生长状态监测中，及早得到微生物的生长信息。用串联式压电传感器，分析培养基不同成分对微生物生长压电信号的影响；用单因素分析方法，分析不同成分对耻垢分枝杆菌和结核分枝杆菌生长曲线的影响。将M7H9培养基中成分的作用分为缓冲作用、合成代谢作用、生长促进因子作用，构建分枝杆菌压电检测体系。对压电频移曲线进行分类，将压电频移信号产生的物质基础分为分解代谢所分泌电导成分和合成代谢所吸收电导成分两种类型，分别产生向下的频移曲线和向上的频移曲线，提升对串联式压电微生物传感器频移信号的理论认识。用噬菌体成斑率为指标，研究噬菌体在环境中稳定的条件，保证噬菌体的感染效率；研究噬菌体最佳的灭活方法，减少实验过程出现假阳性。分析钙镁浓度对噬菌体吸附、顿挫感染的影响，得出最佳的钙离子浓度、杀毒剂硫酸亚铁胺浓度。用一步生长曲线研究噬菌体D29与耻垢分枝杆菌作用的特性，分析影响噬菌体生物放大作用的外部环境因素，优化出最适合结核分枝杆菌快速检测的培养基配方。综合考虑噬菌体的稳定条件、灭活条件、一步生长曲线的最优条件和耻垢分枝杆菌在M7H9培养基中压电信号的影响因素，选择适合构建噬菌体生物放大的压电传感器检测培养体系。结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌能被噬菌体D29感染，保护菌体内的噬菌体D29不被硫酸亚铁杀灭。样品中的结核分枝杆菌被作为载体，将加在样品处理液中的噬菌体D29转移到检测池。在检测池中，噬菌体D29裂解结核分枝杆菌释放子代噬菌体，子代噬菌体感染耻垢分枝杆菌，经历快速的感染、复制、裂解的循环过程。这个循环过程构成噬菌体链式生物放大反应，最终得到完全抑制耻垢分枝杆菌生长的结果。样品中结核分枝杆菌的浓度不同，转移到检测池中的噬菌体D29的也浓度不同，完全抑制耻垢分枝杆菌生长所需的循环次数不同，最终导致检测池中耻垢分枝杆菌生长程度不同。当样品中没有结核分枝杆菌充当噬菌体的载体时，则无噬菌体被转移到检测池中，耻垢分枝杆菌的生长不受噬菌体抑制。耻垢分枝杆菌在生长过程中，利用培养基中的电导成分，引起压电传感器产生频移响应信号。不同浓度的结核分枝杆菌引起不同强度的压电频移响应信号。在液体培养基中，充分发挥噬菌体的链式放大作用，提高检测方法灵敏度。应用压电传感器对电参数的灵敏响应，提高检测方法的灵敏度。通过噬菌体D29桥梁作用，将慢速生长的结核分枝杆菌检测，转换成快速生长的耻垢分枝杆菌的检测，大大提高检测速度。噬菌体对结核分枝杆菌的裂解作用，可降低实验风险，安全可靠。耻垢分枝杆菌检测所需要培养基和仪器要求低，成本低廉。用数学模型分析检出时间与溶液中噬菌体浓度的关系，得出检测时间与溶液中1-102pfu/mL噬菌体D29浓度成线性的结果。用双盲对照的原则研究样本处理对检测方法的影响，得出正确的样本处理方法，保证结果的准确度，避免假阳性和假阴性。该方法可以检测102cfu/mL的结核分枝杆菌，检测时间缩短到30小时，具有临床诊断实用价值。噬菌体放大多通道压电传感器法（PA-MSPQC）与Bactec MGIT960法的统计学比较结果，得出两者检测临床样本的灵敏度和特异度一致。但PA-MSPQC法检测时间只需30小时，优于培养法。PA-MSPQC法还可以通过提高噬菌体感染效率，进一步提高方法的灵敏度。防止耐药结核分枝杆菌的出现是控制结核病的关键措施，实现结核分枝杆菌菌株耐药的快速检测，对合理用药和防止耐药菌株的出现有非常重要的意义。我们根据噬菌体只能感染活的结核分枝杆菌的特点，将PA-MSPQC法应用于结核分枝杆菌耐药检测。建立PA-MSPQC法耐药结果的频移标准，根据实验条件和比例法耐药的判别标准，对利福平、异烟肼和乙胺丁醇三种药物，当耻垢分枝杆菌生长引起的频移小于121Hz时，认为菌株对药物耐受；对链霉素药物，当耻垢分枝杆菌引起的压电频移小于92Hz时，判定菌株对链霉素耐药。将双盲实验中，PA-MSPQC法所得的结果与MGIT960法所得结果进行统计学分析，得出PA-MSPQC法与MGIT960法没有统计学差异，能准确检测临床结核分枝杆菌菌株对利福平、异烟肼、乙胺丁醇和链霉素等一线抗结核药物的耐受情况。由于PA-MSPQC法能快速报告实验结果，可以替代传统的培养法用于临床结核分枝杆菌菌株的耐药实验。但是PA-MSPQC同样存在噬菌体感染效率的问题，有可能将未感染噬菌体的结核分枝杆菌当成耐药菌株，影响方法的准确度。因此，优化培养基成分是提高检测方法灵敏度，提高耐药实验准确度的关键。为建立微生物快速传感检测新方法，我们使用石墨烯新材料和核酸序列代替适配体进行初步实验。用化学气相沉积法在铜箔表面制备大面积石墨烯，用拉曼光谱分析在不同气体条件下形成石墨烯的质量，研究氢气流量、温度、基底材料对石墨烯质量的影响，直接制备出可用于电极分析的大面积单层石墨烯。用电化学阻抗谱和循环伏安法研究核酸序列在石墨烯电表面吸附和解离的条件，得出钠的浓度在100mmol/L、镁的浓度在5mmol/L，核酸序列通过π-π堆集作用而吸附，电极表面电子传递阻力增大；在钙、镁离子的存在条件下，吸附的核酸序列与互补序列作用解离，电极表面电子传递阻力减小；电极表面的电子传递阻力的拟合分析得出，电子传递阻力的改变与cDNA浓度成线性关系。适配体是与核酸序列同性质的DNA序列，石墨烯电极和适配体为目标分析物（如病原微生物）的快速传感检测提供可能。
张文艳,柯文鸿,张洁莹,徐东芳,王莉丽[5]（2012）在《合肥地区结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB突变特征研究》文中指出目的:了解合肥地区结核分枝杆菌利福平（RFP）耐药株rpoB基因突变特点。方法:应用PCR-直接测序法对合肥地区肺结核病人痰液中分离的90株结核分枝杆菌的rpoB基因629 bp（包括rpoB基因利福平耐药决定区（RRDR）的81 bp）序列进行测定分析。结果:90株结核分枝杆菌中69株对RFP耐药,21株对RFP敏感;69株耐利福平临床分离株中53株发生rpoB基因突变,突变率为76.8%;突变发生在531位丝氨酸的31株,发生率为44.9%,发生在526位组氨酸的8株,发生率为11.6%;还有6株发生了联合突变,发生率为8.7%。21株敏感株中1株rpoB基因发生突变,突变位点是533位亮氨酸。结论:合肥地区结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB基因的RRDR发生了突变,其中531位丝氨酸和526位组氨酸是最常见的突变位点。
杜蓬,李峰,董兆麟,陈超[6]（2012）在《西安市耐利福平结核分枝杆菌rpoB基因的突变型分析》文中认为目的西安市结核分枝杆菌临床分离株rpoB基因RRDR的基因型分析。方法采用PCR-单链构象多态性（PCR-SSCP）分析32株结核分枝杆菌耐RFP株和10株RFP敏感株的rpoB基因PCR产物,并对8株具有代表性的菌株rpoB基因片段通过DNA测序进行验证。结果 rpoB基因PCR-SSCP分析灵敏度为56.3%（18/32）,特异性为80%（8/10）。8株结核分枝杆菌rpoB基因经测序,6株耐RFP菌株中有5株的rpoB基因突变均发生在531或526密码子上。其中有两株在526密码子均发生了双碱基突变;1株PCR-SSCP呈现阴性的耐RFP结核分枝杆菌存在513密码子突变;两株RFP敏感株出现PCR-SSCP假阳性,其rpoB基因均涉及2～3个密码子的突变,其中518密码子突变型AAC→GAC为首次报道。结论 531和526密码子除了单点突变之外,亦出现同密码子双碱基突变型;RFP敏感株多密码子突变型值得关注。
谭景尹[7]（2011）在《PCR—膜芯片?技术检测结核杆菌耐药基因突变的应用研究》文中研究说明20世纪80年代后期以来,伴随人类免疫缺陷病毒（HIV）感染的流行、结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）耐药菌株的出现以及流动人口的增加,全球结核病（tuberculosis,TB）疫情急剧恶化,严重威胁着人类健康。目前,全世界每年TB死亡人数高达300万。随着联合药物的使用,MTB的耐药菌株也在不断的出现和传播。据WHO 2008年1月的调查报告[1]显示,耐药结核病（drug-resistant tuberculosis,DR-TB ）的发病率创历史最高纪录,中国结核病耐药的严重程度在全球范围内仅次于俄罗斯,DR-TB已成为我国严重的公共卫生和社会问题。结核病实验室诊断和耐药性检测技术研究一直是国内外共同关注的焦点[2]。MTB培养加药敏试验仍是目前临床广泛采用鉴定MTB及其耐药性的“金标准”,但它对结核杆菌尤其是耐药菌株的检出率很低,所需时间较长,无法满足临床辅助诊断与指导用药的需要[3,4]。反向点膜杂交（reverse dot blot hybridization ,RDB）法应用DNA探针、核酸杂交、酶联显色3方面技术,同时检测MTB多个药物的耐药性[5],是目前国内外研究的热点。本课题组在前期研究中,以临床分离株为对象利用RDB法初步构建了检测耐药结核杆菌的膜芯片及反应体系。本研究以石蜡包埋组织标本为对象,从DNA的提取方法、多重PCR的反应体系及膜芯片的杂交条件三方面对整个检测体系进行优化,并将优化后的PCR-膜芯片体系直接用于检测石蜡包埋组织及痰液等临床标本的非培养结核杆菌及其耐药情况,结合药敏试验及测序结果对PCR-膜芯片检测结果进行比较分析。目的:优化结核分枝杆菌耐药基因膜芯片检测体系,探讨PCR-膜芯片技术直接应用于临床标本中结核杆菌耐药性检测的方法。方法:1、以石蜡包埋组织标本为对象,首先对提取DNA的方法进行优化。分别以氯化钠盐析法、酚-氯仿抽提法、一步法、试剂盒法提取石蜡包埋组织中结核杆菌的DNA,并通过琼脂糖凝胶电泳、PCR及TB膜芯片分析所提取DNA的质量;2、根据课题组前期建立的结核杆菌多重PCR体系扩增石蜡包埋组织中结核杆菌的耐药基因,通过调整引物组合、模板DNA的加入量及PCR反应的循环次数进行优化;3、根据课题组前期建立的结核杆菌耐药膜芯片体系检测石蜡包埋组织中结核杆菌耐药基因突变,通过调整膜芯片杂交时间及显色时间进行优化;4、综合各项优化条件,构建优化后PCR-膜芯片检测体系。5、采集100例石蜡包埋的肺或淋巴结组织标本（结核病人80例,非结核病人20例）,采集82例痰标本（结核病人64例,非结核病人18例）;6、利用TB膜芯片检测石蜡包埋组织标本和痰标本中的结核杆菌IS6110基因,结果与抗酸染色镜检及痰涂片结果进行比较分析;7、利用优化的PCR-膜芯片检测体系,直接检测TB膜芯片阳性的石蜡包埋组织及痰标本中的结核杆菌及其耐药基因突变,结果与药敏试验及DNA测序结果进行分析比较。结果:1、氯化钠盐析法提取的DNA （19.338±6.270μg）和一步法提取的DNA（20.050±5.591μg）最多（P<0.001）,PCR与TB膜芯片验证显示氯化钠盐析法与酚-氯仿法提取到质量较高的结核杆菌DNA;2、扩增石蜡包埋组织中结核杆菌耐药基因的多重PCR的最适条件为:引物组合调整为RKE、IAG、PRP、RRI,模板DNA的加入量为5μl, PCR反应的循环次数为38;3、检测石蜡包埋组织中结核杆菌耐药基因突变膜芯片杂交的最适条件为:杂交时间为6h及以上,显色时间为15min;4、TB膜芯片检测石蜡包埋组织标本和痰标本中的结核杆菌IS6110基因,特异度分别为100%（20/20）和100%（18/18）,灵敏度分别为52.5%（42/80）和81.3%（52/64）。5、优化后PCR-膜芯片直接检测石蜡包埋组织结核杆菌耐药基因突变,在42例TB膜芯片确认结核杆菌阳性的标本中,检出5例存在耐药基因的突变,其突变位点与测序结果基本符合。6、优化后PCR-膜芯片直接检测痰样结核杆菌耐药基因突变,在52例确认结核杆菌阳性的痰样中,检出5例存在耐药基因突变,其中4例临床药敏试验显示为耐药,该4例标本的PCR-膜芯片检测结果与药敏及测序结果基本符合;在痰培养阴性的样本中,PCR-膜芯片检测1例出现耐药基因突变,突变位点与测序结果一致,提示异烟肼耐药的可能。结论:1、氯化钠盐析法具有高效简便的特点,是较为理想的石蜡包埋组织结核杆菌DNA的提取方法。2、TB膜芯片检测石蜡包埋组织标本和痰标本中结核杆菌,检出率明显高于抗酸染色镜检法和痰涂片法。3、优化后PCR-膜芯片体系可直接检测石蜡包埋组织及痰样等临床标本结核杆菌耐药基因突变;48小时内提供耐药信息,为临床耐药结核病的快速诊断提供有意义的辅助参考。
陈丹华[8]（2011）在《膜反向斑点杂交技术在结核分枝杆菌耐药突变株检测领域的应用》文中研究表明近些年来,结核病在全球表现出了死灰复燃的现象,这为预防和治疗结核病带来了巨大的挑战。特别是耐药（ DR-TB）和耐多药（MDR-TB）结核病具有分布广,传播快的特点,所以结核病已被认为是当前在全球控制传染性疾病所面临的严峻课题之一。在结核病的治疗中,所用到的一线抗结核药物主要有异烟肼（ INH）、利福平（ RFP）、链霉素（ SM）等,因此各个国家都非常重视对耐此类药物的结核分枝杆菌的研究。在当前,对结核分枝杆菌的耐药性分析的规范方法和金标准是传统的培养方法,但是这种方法在整个检测的过程中消耗的时间特别长,因而不能有效地了解并进行正确地治疗结核病。异烟肼（INH）与利福平（RFP）是二种很高效的抗结核药物,所以一直以来都在对结核治疗中起相当重要的作用。其中耐异烟肼的产生原因是因为过氧化氢酶-过氧化物酶的编码基因katG基因的缺失和突变造成,常见的是第315位的丝氨酸突变为苏氨酸,这一突变导致此酶对于其底物INH的亲和性降低,使得过氧化氢酶一过氧化物酶丧失了近一半的酶活性,在所有INH耐药株中大概有50%的突变为这种形式并导致对INH高度耐药。耐利福平的产生与其核心区域rpoB基因突变有关。此区域65%-86%的突变发生在第526位由组氨酸突变为酪氨酸和第531位由丝氨酸突变为亮氨酸,而且此突变将导致对利福平的高度耐药（MIC>32ug/ml）。因此,着眼于当今已知的耐药突变位点的代表性,本研究选取katG （315）和rpoB （531）突变位点作为研究检测的对象。本研究通过对膜反向斑点杂交技术在检测结核耐药性的最佳条件的反复摸索,最终确立采用孔径为0.45μm的尼龙膜,探针的终浓度为1.5 pmol/μL,杂交温度60℃、杂交时间30 min、洗膜温度为60℃,洗膜时间20 min的条件来检测结核分枝杆菌的耐药性。并且通过实验结果显示,在此条件下应用膜反向斑点杂交技术成功地检测了结核分支杆菌耐异烟肼katG基因及耐利福平rpoB基因的突变,并且与DNA测序技术做比较,检测准确性为100%。所以膜反向斑点杂交技术以简便、快速、灵敏、特异的方式直接检测结核分支杆菌katG、rpoB基因突变,可以为临床检测结核分支杆菌的耐药性提供辅助诊断手段,为开发检测结核耐药性试剂盒奠定了实验基础。
陈影[9]（2011）在《噬菌体法检测痰标本结核分枝杆菌及其耐药性的研究》文中进行了进一步梳理目的利用噬菌体生物扩增法（phage amplified biologically assay, PhaB法）快速检测结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis, MTB）及其对利福平（rifampin, RFP）、异烟肼（isoniazid, INH）、左氧氟沙星（levofloxacin, LVFX）的耐药性。建立一种特异性强、敏感性高的MTB检测及药敏实验方法。方法通过PhaB法进行结核菌的检测、培养及药物敏感性测定,以绝对浓度法为对照,来分析其实验方法的灵敏度、特异性及药物敏感性同传统方法的符合程度。进而来进行临床应用,指导临床诊断治疗。结果（1）应用10例结核分支杆菌分别在102、5×102、103、104、105 cfu/ml浓度,（麦氏比浊管3.0浊度相当于细菌浓度107 cfu/ml）进行PhaB法检测结核菌。该方法检出最低浓度为5x102 cfu/ml。（2）应用PhaB法检测铜绿假单胞菌、肺炎双球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等呼吸道常见细菌,结果均为阴性。应用PhaB法检测非典型分支杆菌10株、牛分支杆菌10株、结核分支杆菌10株,结果均为阳性。（菌液浓度均为105 cfu/ml）其特异性达到100%。（3）肺结核患者临床痰标本105例,直接进行PhaB法结核菌检测。涂阳培阳标本该方法检出率为95.2%,涂阴培阳标本检出率为75.0%,涂阴培阴标本检出率为23.1%。（4）PhaB法药敏同传统罗氏绝对浓度法的符合率87.7%,分别为利福平88%、异烟肼85.3%、左氧氟沙星90.0%。结论PhaB法可快速检测痰标本中MTB,肺结核检出率明显高于涂片法,敏感性高,特异性高；PhaB法检测MTB对异烟肼、利福平及左氧氟沙星的耐药性,与传统方法比较药敏符合率较高,报告时间只需3d,且无需特殊仪器、费用低,对指导临床早期诊断与治疗具有重要意义。
付佑辉[10]（2009）在《显微镜观察药物敏感性技术快速检测结核分枝杆菌及其耐药性的研究》文中研究指明目的:探讨显微镜观察药物敏感性技术（MODS）快速检测结核分枝杆菌及四种一线抗结核药物、四种二线抗结核药耐药性的效果。方法:将MODS技术应用于100株临床分离株的快速检测并对其方法学进行探讨,将结果与传统罗氏培养和鉴定法结果进行比较;将MODS药敏检测技术用于测定60株结核分枝杆菌临床分离株对链霉素、异烟肼、利福平、乙胺丁醇、丙硫异烟胺、阿米卡星、卷曲霉素、左氧氟沙星的耐药性并对其最佳检测条件进行探讨,将检测的结果与传统罗氏药敏结果进行比较,对两法检测结果不符的菌株进行最低抑菌浓度（MIC）测定。结果:菌液浓度为3×103 CFU/ml时运用MODS技术检测判读结果时间为7天;4种非结核分枝杆菌（草分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、龟分枝杆菌、海分枝杆菌）在液体培养基中观察到呈索状结构生长,镜下难于和结核分枝杆菌在液体培养基中生长形成的特征索状结构区分;以对硝基苯甲酸（PNB）800μg/ml、噻吩-2-羧酸肼（TCH）2.5μg/ml为检测条件,能提高检测的正确率;临床分离株检测结果表明,本法检测结核分枝杆菌与传统罗氏培养和鉴定法结果符合率为97%,如以罗氏培养、鉴定法为判断标准,则MODS技术检测结核分枝杆菌的敏感性、特异性、阳性预测值（PPV）、阴性预测值（NPV）、正确性分别为95.7%,100%、100%、99.9%、97%; MODS技术检测链霉素、异烟肼、利福平、乙胺丁醇、阿米卡星、卷曲霉素、左氧氟沙星药敏结果与罗氏药敏结果符合率分别为95.0%、98.0%、98.0%、93.3%、91.7%、98.0%、91.7%、96.7%。如以传统罗氏药敏结果为判断标准,则MODS技术检测链霉素、异烟肼、利福平、乙胺丁醇、丙硫异烟胺、阿米卡星、卷曲霉素、左氧氟沙星的敏感度、特异性、阳性和阴性预测值及准确性分别为92.0%、95 .0%、95 .8%、90 .9%、100%、100%、76.9%、87.5%;97.1%、100%、100%、93.9%、87.5%、90.0%、95.7%、96.0%;95.8%、100%、100%、76.9%、87.5%、90.0%、83.3%、83.3%;94.4%、97.6%、97.3%、97.9%、100%、100%、93.8%、100%;95.0%、98.3%、98.3%、93.3%、96.7%、98.3%、91.7%、96.7%;结论: MODS技术检测结核分枝杆菌及链霉素、异烟肼、利福平、乙胺丁醇、丙硫异烟胺、阿米卡星、卷曲霉素、左氧氟沙星耐药性具有快速、操作简便、价廉等优点,与传统罗氏法结果有较高的符合率,可作为结核分枝杆菌及耐药性的快速检测方法之一。
二、DNA测序、PCR-SSCP和phaB间接药敏实验检测结核分枝杆菌利福平耐药性的比较（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、DNA测序、PCR-SSCP和phaB间接药敏实验检测结核分枝杆菌利福平耐药性的比较（论文提纲范文）
（1）高分辨率熔解曲线技术用于结核分枝杆菌临床分离株异烟肼耐药性的快速检测（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器与设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 比例法药敏实验 |
| 1.2.2 结核分枝杆菌DNA的提取及HRM检测模板浓度的标准化 |
| 1.2.3 异烟肼耐药决定区 (IRDR) DNA测序分析 |
| 1.2.4 高分辨率熔解曲线 (HRM) 分析 |
| 1.2.5 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 比例法药敏实验结果 |
| 2.2 异烟肼耐药决定区 (IRDR) DNA测序分析结果 |
| 2.2.1 目的基因KatG和inhA的扩增结果 |
| 2.2.2 目的基因KatG和inhA的测序分析 |
| 2.2.3 各菌株在异烟肼耐药决定区的突变位点分析 |
| 2.2.4 KatG基因和inhA基因各位点突变类型及密码子变化 |
| 3 评估用HRM对结核分枝杆菌异烟肼耐药性进行检测的价值 |
| 3.1 以DNA测序检测到突变判断菌株耐药性的效率 |
| 3.2 用高分辨率溶解曲线 (HRM) 检测菌株耐药突变的效率 |
| 3.2.1 目的基因KatG和inhA的HRM扩增 |
| 3.2.2 KatG基因和inhA基因突变位点的HRM分析 |
| 3.3 评估高分辨率溶解曲线 (HRM) 检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性的应用价值 |
| 4 讨论 |
（2）基因芯片法检测结核分枝杆菌耐药性的可行性分析（论文提纲范文）
| 1 资料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
（3）中国结核菌耐多药和广泛耐药相关基因突变特征及MAS-PCR研究（论文提纲范文）
| Abbreviation（缩略词） 中文摘要 ABSTRACT 前言 第一部分 中国耐多药和广泛耐药结核分枝杆菌耐药相关基因突变特征分析 |
| 材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| 二、试验方法 |
| 实验结果 |
| 一、药物敏感性实验结果 |
| 二、耐药相关基因测序结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 第二部分 MAS-PCR 技术用于诊断耐多药和广泛耐药结核病的研究 |
| 材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 结果 |
| 1. 比例法检测药敏结果 |
| 2. 测序结果 |
| 3. MAS‐PCR 检测结核分枝杆菌耐药性结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 本研究基金资助项目 已发表文章 文献综述 |
| 参考文献 致谢 |
（4）新型噬菌体压电传感器快速检测结核分枝杆菌的机理及其药敏应用效果的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景和意义 |
| 1.2 结核分枝杆菌检测的历史与现状 |
| 1.2.1 涂片检测 |
| 1.2.2 培养检测 |
| 1.2.3 血清学检测方法 |
| 1.2.4 分子生物学方法 |
| 1.3 结核分枝杆菌的耐药检测 |
| 1.3.1 结核分枝杆菌耐药的分子机理 |
| 1.3.2 耐药菌株的检测方法 |
| 1.4 压电传感技术的进展 |
| 1.4.1 压电传感器原理和构建 |
| 1.4.2 压电传感器的分类 |
| 1.4.3 触液式压电传感器的应用 |
| 1.4.4 气相压电传感器的响应特点和应用 |
| 1.5 本文研究的主要内容 |
| 第二章 结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌压电检测体系的构建 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 分枝杆菌和耻垢分枝杆菌悬液的制备 |
| 2.2.2 不同糖类的YC培养基的制备 |
| 2.2.3 仪器设备 |
| 2.2.4 实验步骤 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 压电石英晶体传感器的构建和电参数响应特性 |
| 2.3.2 结核分枝杆菌在不同培养基中信号的代谢机理 |
| 2.3.3 耻垢分枝杆菌在不同培养基中信号的代谢机理 |
| 2.3.4 结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌在YC和M7H9 上的生长信号差异 |
| 2.3.5 耻垢分枝杆菌在M7H9 培养基中的响应机理 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 噬菌体D29 与耻垢分枝杆菌作用的生物学特性研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 仪器与试剂 |
| 3.2.1 试剂与菌株 |
| 3.2.2 仪器与设备 |
| 3.3 实验部分 |
| 3.3.1 耻垢分枝杆菌增殖培养方法 |
| 3.3.2 结核分枝杆菌培养保存方法 |
| 3.3.3 噬菌体的增殖培养方法 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 噬菌体D29 的化学和物理特性 |
| 3.4.2 耻垢分枝杆菌吸附噬菌体D29 的位点分析 |
| 3.4.3 噬菌体D29 在耻垢分枝杆菌中的一步生长曲线 |
| 3.4.4 pH对噬菌体在不同培养基中稳定性的影响 |
| 3.4.5 阳离子对噬菌体D29 吸附宿主细胞的影响 |
| 3.4.6 Tween 80 对噬菌体D29 与耻垢分枝杆菌作用的影响 |
| 3.4.7 硫酸亚铁铵浓度的选择 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 噬菌体放大多通道压电石英传感器快速灵敏检测结核分枝杆菌 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 检测培养基和样品处理 |
| 4.2.2 MSPQC检测系统和BACTEC MGIT960 系统 |
| 4.2.3 实验步骤 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 噬菌体放大多通道压电传感器的构建 |
| 4.3.2 噬菌体D29 浓度对耻垢分枝杆菌生长信号的影响 |
| 4.3.3 耻垢分枝杆菌浓度对频移响应曲线的影响 |
| 4.3.4 钙离子对噬菌体D29 与耻垢分枝杆菌之间作用的影响 |
| 4.3.5 PA- MSPQC检测结核分枝杆菌的典型响应曲线 |
| 4.3.6 阳性样本鉴别标准和检测方法下限的确定 |
| 4.3.7 临床样本的检测 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 噬菌体压电传感器快速检测结核分枝杆菌药物敏感实验 |
| 5.1 引言 |
| 5.1.1 分子生物学检测方法 |
| 5.1.2 突变位点基因的检测方法 |
| 5.1.3 表型分析方法 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 试剂与菌株 |
| 5.2.2 仪器与设备 |
| 5.3 实验步骤 |
| 5.3.1 噬菌体溶液的制备 |
| 5.3.2 耻垢分枝杆菌菌悬液 |
| 5.3.3 痰样试液的制备 |
| 5.3.4 实验菌株耐药的处理 |
| 5.3.5 药物作用效果的检测 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 药物敏感性判定的依据 |
| 5.4.2 四种抗结核药物的噬菌体压电响应曲线 |
| 5.4.3 结核菌株耐药和敏感的判定标准 |
| 5.4.4 PA-MSPQC法与MGIT法药敏结果的比较 |
| 5.4.5 PA-MSPQC法与MGIT 960 法检测临床菌株报告时间的比较 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 无标记ssDNA在大面积单层石墨烯电极上吸附解离的电化学阻抗谱分析 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验仪器与试剂 |
| 6.2.1 实验仪器 |
| 6.2.2 实验部分 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 化学气相沉积法在铜基底上制备石墨烯的原理 |
| 6.3.2 化学气相沉积法制备石墨烯的主要影响因素 |
| 6.3.3 氢气浓度对石墨烯质量的影响 |
| 6.3.4 石墨烯电极的循环伏安研究 |
| 6.3.5 石墨烯探针DNA电极与目标DNA作用的电化学阻抗谱 |
| 6.3.6 ssDNA在石墨烯表面吸附的影响因素 |
| 6.3.7 ssDNA在石墨烯表面吸附作用力分析 |
| 6.3.8 氧化石墨烯与石墨烯在与ssDNA作用上的差别 |
| 6.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 攻读博士学位期间所发表的学术论文 |
| 致谢 |
（5）合肥地区结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB突变特征研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 结核分枝杆菌标准株 |
| 1.2 临床菌株 |
| 1.3 DNA的提取 |
| 1.4 引物序列 |
| 1.5 rpoB基因目的片段的扩增 |
| 1.6 PCR产物纯化及DNA测序 |
| 1.7 序列比对与分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 RFP耐药性检测结果 |
| 2.2 rpoB基因PCR扩增结果 |
| 2.3 rpoB基因测序分析结果 |
| (1) 利福平敏感株测序结果: |
| (2) 利福平耐药菌株测序结果: |
| 3 讨论 |
（6）西安市耐利福平结核分枝杆菌rpoB基因的突变型分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 结核分枝杆菌标准株及临床分离株基因组DNA的提取 |
| 1.3 结核分枝杆菌rpoB基因RRDR片段的PCR检测 |
| 1.4 基于聚丙烯酰胺凝胶电泳的RRDR片段PCR产物的SSCP分析 |
| 1.5 RRDR扩增片段的DNA测序分析 |
| 1.6 统计学处理 |
| 2 结 果 |
| 2.1 结核分枝杆菌临床分离株rpoB等位基因的PCR-SSCP分析 |
| 2.2 基于PCR-SSCP分析结果的DNA测序验证 |
| 3 讨 论 |
（7）PCR—膜芯片?技术检测结核杆菌耐药基因突变的应用研究（论文提纲范文）
| 主要缩略语 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 主要试剂和仪器 |
| 2 试剂配制 |
| 3 技术路线 |
| 4 标本来源、分类及留取方法 |
| 5 标本处理及 DNA 的提取 |
| 6 石蜡包埋组织 DNA 提纯方法的比较 |
| 7 多重 PCR 扩增结核杆菌耐药基因体系的优化 |
| 8 多探针膜芯片检测结核杆菌耐药基因突变体系的优化 |
| 9 TB 膜芯片检测标本中结核杆菌的 IS6110 基因 |
| 10 PCR-膜芯片 检测标本中结核杆菌的耐药基因 |
| 11 DNA 测序验证 |
| 12 统计分析 |
| 结果 |
| 1 石蜡包埋组织 DNA 提取方法的比较结果 |
| 2 多重 PCR 反应条件的优化结果 |
| 3 多探针膜芯片杂交条件的优化 |
| 4 石蜡包埋组织标本的检测结果 |
| 5 痰标本的检测结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 结核杆菌耐药机制及耐药基因 突变检测方法的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（8）膜反向斑点杂交技术在结核分枝杆菌耐药突变株检测领域的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩写词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 结核分枝杆菌耐药的分子机制 |
| 1.1.1 结核病现状及结核分枝杆菌耐药性 |
| 1.1.2 结核分枝杆菌耐药的分子机制 |
| 1.1.3 结核分枝杆菌耐利福平的分子机制 |
| 1.1.4 结核分枝杆菌耐异烟肼的分子机制 |
| 1.2 结核分枝杆菌耐药性检测方法的近况 |
| 1.2.1 常规药敏试验方法 |
| 1.2.2 BACTEC 液体培养基法 |
| 1.2.3 噬菌体生物扩增法(Phage amplified biologically assay，PhaB) |
| 1.2.4 DNA 测序法 |
| 1.2.5 基因芯片法 |
| 1.2.6 反向杂交技术 |
| 1.3 本论文的研究意义及技术路线 |
| 1.3.1 本论文的研究意义 |
| 1.3.2 本论文的技术路线 |
| 第二章 膜反向斑点杂交技术检测结核耐药性条件的优化 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 质粒和菌株 |
| 2.1.2 主要药品与试剂 |
| 2.1.3 主要设备与仪器 |
| 2.1.4 溶液的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 质粒的提取 |
| 2.2.2 PCR 扩增 |
| 2.2.3 膜反向斑点杂交过程 |
| 2.2.4 探针的优化与设计 |
| 2.2.5 探针浓度的优化 |
| 2.2.6 最适杂交温度的优化 |
| 2.2.7 杂交时间的优化 |
| 2.2.8 洗膜温度的优化 |
| 2.2.9 杂交液盐浓度的优化 |
| 2.2.10 生物素标记的扩增产物浓度对杂交结果的影响 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 质粒的电泳鉴定结果 |
| 2.3.2 PCR 扩增结果 |
| 2.3.3 探针的优化与设计结果 |
| 2.3.4 探针浓度的优化结果 |
| 2.3.5 最适杂交温度的优化结果 |
| 2.3.6 杂交时间的优化结果 |
| 2.3.7 洗膜温度的优化结果 |
| 2.3.8 杂交液盐浓度的优化结果 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 膜反向斑点杂交检测结核的耐药性 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 质粒和菌株 |
| 3.1.2 主要药品与试剂 |
| 3.1.3 主要设备与仪器 |
| 3.1.4 溶液配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 引物及寡核苷酸探针的设计与膜的制备 |
| 3.2.2 质粒的提取 |
| 3.2.3 PCR 扩增 |
| 3.2.4 膜反向斑点杂交过程 |
| 3.3 实验结果与讨论 |
| 3.3.1 引物和寡核苷酸探针的设计结果 |
| 3.3.2 质粒的电泳鉴定结果 |
| 3.3.3 PCR 扩增结果 |
| 3.3.4 katG 基因引物的PCR 扩增敏感性结果 |
| 3.3.5 katG 基因PCR-膜反向斑点杂交探针敏感性结果 |
| 3.3.6 膜反斑点杂检测耐药结核分枝杆菌结果 |
| 3.4 小结 |
| 结论与展望 |
| 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 答辩委员会对论文的评定意见 |
（9）噬菌体法检测痰标本结核分枝杆菌及其耐药性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 材料与方法 |
| 1.1 主要仪器设备 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 试剂配制 |
| 1.4 研究对象 |
| 1.5 试验方法 |
| 第二章 结果 |
| 第三章 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（10）显微镜观察药物敏感性技术快速检测结核分枝杆菌及其耐药性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 第二章 显微镜观察药物敏感性技术快速检测结核分枝杆菌的研究 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 材料及方法 |
| 第三节 结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第三章 显微镜观察药物敏感性技术检测结核分枝杆菌耐药性研究 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 材料及方法 |
| 第三节 结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
四、DNA测序、PCR-SSCP和phaB间接药敏实验检测结核分枝杆菌利福平耐药性的比较（论文参考文献）
- [1]高分辨率熔解曲线技术用于结核分枝杆菌临床分离株异烟肼耐药性的快速检测[J]. 杨彩虹,杨敏,于璐,包海洋,吴长新,曹旭东,陈创夫. 中国人兽共患病学报, 2017(05)
- [2]基因芯片法检测结核分枝杆菌耐药性的可行性分析[J]. 胡晓红,向启云,庄倩,李沫,董艳娥. 国际检验医学杂志, 2015(23)
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