一、CML66基因的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备（论文文献综述）
王呈呈[1]（2021）在《K亚群禽白血病病毒gp85表面蛋白的特异基因表达及应用》文中提出K亚群禽白血病病毒（ALV-K）是近些年新发现的一种外源性禽白血病病毒亚群,该亚群主要存在于中国地方鸡群,病毒增殖慢,感染范围广,是我国地方鸡群主要防控对象之一。相对其它亚群禽白血病病毒,该亚群病毒研究起步晚、感染特性和致病机制所知少、缺乏特异性诊断试剂和方法,极大限制了对该病毒深入研究和临床防控检测。本研究旨在根据ALV-K毒株的囊膜表面蛋白基因特性,利用分子生物学、细胞生物学和兽医免疫学等技术方法获得针对该病毒亚群的特异性蛋白抗原和抗体,并建立基于这些抗原抗体介导的特异性检测方法,为该亚群病毒深入研究和临床防控检测提供物质基础和方法依据。本研究首先根据Gen Bank上发表的ALV-K囊膜表面蛋白gp85基因序列,利用生物信息软件筛选出与其他亚群同源性较低的特异性抗原基因片段,设计引物,以ALV-K-JS11C1毒株的基因为模板扩增该基因片段,利用原核表达技术,获得特异性蛋白抗原;其次,对该蛋白抗原进行纯化、鉴定、包被,优化反应条件,建立检测该亚群病毒抗体的ELISA方法,对该方法的特异性、灵敏度、重复性、符合率、保存期等进行评价;第三,利用该蛋白抗原免疫接种兔,制备多克隆抗体,检测其抗体效价和对病毒或抗原的识别特性;第四,利用该蛋白抗原免疫接种Bal b/c小鼠,制备分泌抗体的脾细胞,与SP2/0细胞杂交融合,获得分泌抗体的杂交瘤细胞,对杂交瘤细胞的染色体数目、分泌抗体类型和识别特性进行检测。结果显示,获得特异性的抗原基因片段大小为310bp,与目前发表的ALV-K亚群同源性为92.9%～100%,而与其他亚群同源性为37%～79.7%;系统进化树显示该基因片段与ALV-K亚群毒株基因亲缘关系很近,与其他亚群较远;蛋白结构抗原性较高。经基因克隆、诱导表达,获得大小为30k Da的目的蛋白条带。对该蛋白进行纯化和包被建立ELISA,并对抗原包被浓度、抗体稀释度、反应条件等进行优化,确定抗原包被浓度为0.75μg/m L、血清抗体稀释度为1:800、二抗稀释浓度为1:5000、一抗孵育时间为45min、二抗孵育时间为60min、显色时间10min为最佳条件;ELISA检测阴性血清临界值为0.705,能区分ALV-K与其它ALV-A/B/J亚群的鸡血清抗体;该方法灵敏度较全长蛋白提高近20倍;板内重复性变异系数在0.90%～7.33%之间,板间重复性显示变异系数在0.84%～5.44%;与商品化ALV p27抗体检测试剂盒符合率可达93.48%;试剂盒至少在5个月内有效。利用该重组蛋白免疫兔可获得效价为8.1×105～5.12×107的血清抗体,所获得的抗体可用于免疫印迹分析（Western blotting）识别ALV-K gp85蛋白和间接免疫荧光分析（IFA）识别细胞中的ALV-K病毒。通过细胞融合和多次亚克隆筛选获得两株分泌抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为ALV-K30B、ALV-K23H,其分泌的抗体亚类分别为Ig G2b、Ig G1,制备的腹水抗体效价可达214和212,所产生的抗体可用于Western blotting特异性识别ALV-K gp85蛋白和IFA识别细胞中的ALV-K亚群毒株,而不识别ALV-A/J亚群毒株。以上结果表明,获取的ALV-K gp85特异性基因片段经诱导表达,可获得成功用于特异性检测鸡血清ALV-K抗体的ELISA包被抗原,也可成功用于制备高效价的多克隆抗体和单克隆抗体。所建立的血清抗体检测ELISA具有良好的特异性、敏感性、稳定性和符合率;所制备的特异性抗体可用于ALV-K病毒及其gp85蛋白的特异性检测。
张文君[2]（2021）在《EFEMP1与IZUMO1的相互作用及对受精的影响》文中提出哺乳动物在有性生殖的过程中发生受精作用,其中最关键的步骤是精子与卵子细胞膜的融合。精卵膜融合以精子和卵子表面的多个蛋白质分子相互作用为基础。目前已知精卵膜融合所需的蛋白质相互作用中,最重要的是精子表面的IZUMO1和卵子表面的JUNO之间的相互作用。但仅有IZUMO1和JUNO间的相互作用还不足以促使精卵完成细胞膜融合,这一过程应该还需要许多相关分子与IZUMO1和JUNO相互作用。为了鉴定同IZUMO1和JUNO存在相互作用的蛋白及其对精卵融合的影响,本文用酵母双杂交技术和免疫共沉淀技术鉴定了大鼠EFEMP1与IZUMO1的相互作用,通过间接免疫荧光技术观察了EFEMP1在小鼠睾丸、卵巢、精子和卵子中的定位,以及与IZUMO1在大鼠和小鼠精子上的共定位,最后利用体外授精技术测定了经EFEMP1抗体处理后小鼠精卵的受精率改变,评估EFEMP1在精卵膜融合过程中的作用。首先克隆了大鼠efemp1的cDNA,构建pGAD-efemp1酵母表达载体,分别与实验室保存的p GBK-Izumo1以及p GBK-juno酵母表达载体进行酵母双杂交,结果表明EFEMP1与IZUMO1存在相互作用,与JUNO不存在相互作用。构建p CMV-Flag-efemp1真核表达载体,与实验室保存的p CMV-HA-Izumo1真核表达载体共转染293 T细胞,进行免疫共沉淀实验,结果表明EFEMP1与IZUMO1存在相互作用。构建pET-28a-efemp1原核表达载体,转化E.coli BL21（DE3）感受态细胞,诱导表达并分离纯化EFEMP1-HIS融合蛋白,免疫昆明白小鼠,获得小鼠抗EFEMP1-HIS腹水多克隆抗体,并验证其特异性。以自制的EFEMP1-HIS腹水多克隆抗体作为一抗进行间接免疫荧光实验,观察EFEMP1在睾丸、卵巢、精子和卵子中的定位;以自制的EFEMP1-HIS腹水多克隆抗体和实验室保存的兔抗IZUMO1-GST血清多克隆抗体共同作为一抗进行间接免疫荧光实验,观察EFEMP1和IZUMO1在大鼠精子和小鼠精子中的共定位。结果表明,EFEMP1表达于小鼠睾丸组织肌样细胞的细胞质和各发育阶段精子细胞的细胞质中,表达于小鼠卵巢组织中卵泡细胞的细胞质中以及卵子的细胞质中和细胞膜上;EFEMP1定位于顶体反应前后大鼠精子和小鼠精子的头部和尾部前半段,小鼠MII期卵母细胞的细胞膜上和细胞质中;EFEMP1和IZUMO1共定位于顶体反应后大鼠精子的头部以及顶体反应前小鼠精子的头部。通过体外授精实验观察并对比不做处理的小鼠精卵、经小鼠腹水处理后小鼠精卵以及经EFEMP1腹水多克隆抗体处理后小鼠精卵的受精率。结果表明,经EFEMP1腹水多克隆抗体处理后,小鼠精卵的受精率略低于经小鼠腹水处理后小鼠精卵的受精率,两者均略低于不做处理的小鼠精卵的受精率,但这三组的精卵受精率的差异不显着。本文验证发现EFEMP1与IZUMO1存在相互作用,EFEMP1与JUNO不存在相互作用;发现EFEMP1在小鼠的睾丸组织、卵巢组织以及在顶体反应前后大鼠精子和小鼠精子中的定位,以及EFEMP1和IZUMO1在顶体反应后大鼠精子和顶体反应前小鼠精子的头部存在共定位;经EFEMP1抗体处理后小鼠精卵的受精率略有下降,但其受到的影响不显着。
武春霞[3]（2021）在《牛呼吸道合胞体病毒G基因原核表达及其多克隆抗体的制备》文中指出牛呼吸道合胞体病是由牛呼吸道合胞体病毒（Bovine respiratory syncytial virus,BRSV）引起的一种呼吸系统疾病,该病在全世界分布广泛,其死亡率不高,但发病率很高,一般多发于冬季,对养牛业造成巨大损失。由于病毒粒子较脆弱以及对细胞适应性较差,所以导致病毒分离较困难,一般情况下难以成功。为评估内蒙古地区牛感染BRSV的情况,本实验室在2018年3月至2019年5月期间,从巴彦淖尔、通辽、乌兰浩特、鄂尔多斯、赤峰及呼和浩特这6个地区从有轻度呼吸道症状的牛中随机采集了302份鼻拭子,用RT-PCR的方法检测其阳性率,并送去测序。然后针对BRSV G基因利用生物学软件分析其抗原区,找到相应的核苷酸序列,设计一对特异性引物,用RT-PCR方法扩增BRSV G基因片段并构建表达载体p ET-32a-G,进而对G蛋白进行诱导表达并优化其诱导条件,并用Ni-IDA亲和层析法纯化蛋白,用BCA法蛋白质浓度测定试剂盒测定其蛋白浓度;然后通过SDS-PAGE和Western-blot方法对G蛋白进行分析与鉴定。用表达好的G蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,并用间接ELISA方法测定其抗体效价,将其与标准BRSV阳性血清做对比。结果表明:牛呼吸道合胞病毒（BRSV）总阳性检出率为6.95%（21/302）,其中3.97%为BRSV和BPIV-3混合感染。利用BRSV c DNA为模板成功扩增了G基因,正确构建了p ET-32a-G重组质粒,通过诱导表达获得了分子质量为40 k Da可溶性G重组蛋白。优化表达条件后,纯化浓缩后蛋白浓度为2.07 mg/m L。经Western-blot检测,发现该蛋白具有反应原性。成功制备了多克隆抗体,其最高抗体滴度为217,标准BRSV阳性血清抗体滴度为219,经对比后,证明制备的多克隆抗体滴度较高。综上,本研究为下一步建立BRSV抗体间接ELISA检测方法及亚单位疫苗的研制奠定了基础。
边若菲[4]（2021）在《嗜水气单胞菌胁迫下东北林蛙MHCI基因表达的研究》文中研究指明主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex,MHC）作为一类与免疫应答密切相关的基因群,主要参与抗原的呈递作用。其中MHCI类基因α链的抗原结合部位,是变异最大的区域,与疾病的抗性密切相关。近些年来,由于自然环境变化和其他人为因素,两栖类动物的种群数量呈逐年下降趋势,甚至某些物种的数量已经处于濒临灭绝的边缘,微生物感染是其中的重要原因之一。研究MHC基因在抗感染中的作用已经成为两栖类抗病研究的热点内容。本研究以东北林蛙为主要研究对象,黑龙江林蛙为对比物种,克隆两种蛙MHCI类基因α链全长编码区,通过生物信息学软件分析MHCI类基因特性;同时构建MHCI基因肽结合区的重组原核表达载体,制备多克隆抗体;再采用嗜水气单胞菌和LPS进行胁迫,利用实时荧光定量PCR技术分析MHCI m RNA转录情况;再通过HE染色法和免疫组织化学法观察东北林蛙病理学变化及蛋白表达情况,为两栖类MHCI类基因的免疫功能研究提供理论基础。主要研究结果如下:（1）本研究克隆东北林蛙和黑龙江林蛙的MHCIα基因全长编码区,获得编码区长度均为1047bp,编码348个氨基酸。两种林蛙核苷酸和氨基酸同源性分别为88.7%和97%;东北林蛙有1个糖基化位点,33磷酸化位点,而黑龙江林蛙有3和19个;二者均含有一个IGc1功能域;进化关系表明,东北林蛙、黑龙江林蛙与中国林蛙的同源性最高,与哺乳类和禽类亲缘关系最远。（2）本研究构建了东北林蛙MHCI基因α链肽结合区的重组表达载体,诱导的重组蛋白大小为39k D,免疫家兔后获得多克隆抗体效价为1:20000。（3）采用实时荧光定量PCR技术检测,正常生理情况下MHCI类基因在东北林蛙和黑龙江林蛙各组织中均表达,但在脾脏中具有较高的表达量。（4）在嗜水气单胞菌和LPS胁迫下,东北林蛙和黑龙江林蛙肺脏、肾脏、脾脏和皮肤的MHCI类基因转录水平都偏高,而在肝脏和肌肉组织中MHCI类基因对LPS的响应更为积极。在嗜水气单胞菌感染模型中,东北林蛙肝脏、脾脏和皮肤在6h到达峰值,肺脏和肌肉组织中在12h达到峰值,而肾脏组织则在24h时达到峰值;黑龙江林蛙肝脏、脾脏、皮肤和肌肉中MHCIm RNA在6h就出现了最高峰,而在肺脏和肾脏中的峰值分别出现在感染后12h和24h。在LPS感染模型中,东北林蛙MHCI基因在被检组织中均呈现上调表达,其肺脏和皮肤在12h达到峰值,肝脏和脾脏分别在24h和48h达到最高峰,而肾脏和肌肉组织均在72h达到峰值;黑龙江林蛙肝脏和肌肉组织中MHCIm RNA分别在6h和12h达到最高峰,肾脏和皮肤组织在24h达到峰值;脾脏和肺脏中的峰值分别出现在48h和72h,而在心脏组织中两种蛙MHCI基因整体转录水平较低。（5）经HE染色显示,在嗜水气单胞菌和LPS胁迫下会导致东北林蛙肝脏、皮肤和肌肉组织随着感染时间延长,细胞损害加剧。免疫组织化学结果显示,与对照组相比,感染嗜水气单胞菌和LPS后东北林蛙肝脏、皮肤和肌肉出现了更多的棕黄色阳性颗粒,其中嗜水气单胞菌胁迫下东北林蛙肝脏和皮肤在6h就出现较多棕黄色颗粒,而肌肉组织在12h才出现阳性颗粒明显增多的现象;LPS胁迫下东北林蛙肝脏、皮肤和肌肉MHCI蛋白表达量分别在24h、12h和72h为最高。本研究对东北林蛙和黑龙江林蛙MHCIα基因进行克隆,对东北林蛙MHCI肽结合区进行原核表达并制备多克隆抗体;对嗜水气单胞菌和LPS胁迫下两种林蛙MHCI在不同组织中的变化规律进行了分析。本研究为两栖类MHCI基因的免疫功能研究提供了理论依据,同时也为两栖类进化、传染病抗性等问题的研究提供新的思路。
吕照勇[5]（2021）在《基于羊巴贝斯虫球状体蛋白3（SBP3）基因的检测方法建立》文中研究指明巴贝斯虫广泛分布在世界的温带、热带及亚热带地区,对人类和动物健康造成严重危害。巴贝斯虫不同于弓形虫、疟原虫等顶复门原虫,其顶端复合体除了有微线体（Microneme）、棒状体（Rhoptry）之外,还有球状体（Spherical bodies）,但并未发现致密颗粒（Dense granules）的存在。本研究从我国分离的6株羊巴贝斯虫基因组DNA和c DNA中扩增SBP3基因全长序列,进行基因序列比对及结构特征与遗传进化分析,以阐述我国羊巴贝斯虫SBP3的基因学特征和各个虫株间的分类关系;并以其为靶标分子分别建立荧光定量PCR检测方法、巢式PCR检测方法和高分辨率熔解曲线分析方法,以满足不同检测目的的需求;利用原核表达系统获得羊巴贝斯虫未定种新疆株SBP3重组蛋白,并制备了其多克隆抗体,为评价SBP3作为免疫学检测候选抗原的潜力提供了生物学材料。主要研究内容和结果如下:1.从我国分离的6株羊巴贝斯虫基因组DNA和c DNA中扩增了SBP3基因的全长序列;利用生物信息学分析软件,进行基因序列比对、结构特征分析和遗传进化分析,结果显示,羊巴贝斯虫SBP3基因无内含子,羊巴贝斯虫未定种新疆株/敦煌株、莫氏巴贝斯虫宁县株/河北株和莫氏巴贝斯虫临潭株/天祝株的SBP3基因全长分别为3 195 bp、3 351 bp和3 348 bp;遗传进化分析结果显示,我国分离的六株羊巴贝斯虫可分为2个种,其中莫氏巴贝斯虫内可能存在2个亚种。2.以我国6株羊巴贝斯虫SBP3基因为分子靶标,通过序列分析,设计特异性引物,成功建立了可检测我国6株羊巴贝斯虫的荧光定量PCR、鉴别检测两种羊巴贝斯虫的巢式PCR和鉴别检测两个种羊巴贝斯虫及莫氏巴贝斯虫两个亚种的高分辨率熔解曲线分子检测方法。这三个分子检测方法均具有良好的特异性和敏感性,与感染羊的吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫和绵羊无浆体均无交叉反应,对羊巴贝斯虫基因组DNA最低检测限为0.5 pg-10 pg。3.以羊巴贝斯虫未定种新疆株SBP3基因序列为模板,设计引物,扩增出不含信号肽序列的SBP3基因片段,构建原核表达载体p ET-28a-BXJSBP3,将其转入大肠杆菌BL21并进行诱导表达和SDS-PAGE分析。结果显示,大小为130 k Da的重组蛋白（r BXJSBP3）成功表达,同时在2、4、6和8小时表达量无明显差异;经超声破碎和可溶性分析,发现其主要以包涵体形式进行表达;对r BXJSBP3进行纯化以及浓度测定,获得浓度为200μg/m L的可溶性r BXJSBP3;以纯化的r BXJSBP3免疫试验兔制备多克隆抗体,对多克隆抗体进行Western blot分析,发现其能够特异性识别r BXJSBP3和羊巴贝斯虫未定种新疆株裂殖子天然SBP3蛋白。该研究为进一步评价SBP3作为免疫学检测候选抗原的潜力和功能的研究提供了生物学材料。
曹云雷[6]（2021）在《ASFV免疫保护相关抗原的抗体制备及应用》文中进行了进一步梳理非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是一种高传染性的猪病毒性疾病,在国内猪中死亡率接近100%。ASF是由一种大型双链DNA病毒ASF病毒（African swine fever virus,ASFV）引起的,它主要在巨噬细胞的细胞质中复制。这种病毒的自然宿主包括家猪、野猪和软蜱。ASFV感染家猪通常会导致致命的出血热,有时感染会是无症状的,并发展为持续性感染。2018年8月中国首例ASF在沈阳被确诊,随后迅速传播至我国30多个省份和地区,给我国养猪业造成了迄今最为惨重的经济损失。目前还没有有效的疫苗可用,因此,防控此病主要依赖病原感染的检测及生物安全措施。本研究通过PCR技术扩增出ASFV的p17、p30、p54和p72蛋白基因,并将它们连入原核表达载体中。然后纯化p17、p30、p54、p72四种重组蛋白,以纯化的重组蛋白作为免疫原,制备了抗p17、p30、p54和p72蛋白的多克隆抗体,以及p54蛋白的单克隆抗体。用纯化的p54蛋白和及其单克隆抗体建立了ASFV间接及竞争ELISA抗体检测方法。1.ASFV编码p17、p30、p54和p72蛋白基因的原核表达及其多克隆抗体的制备参考ASFV SY18毒株（Gen Bank:MH713612.1）的D117L基因、CP204L基因、E183L基因和B646L基因序列,将D117L基因和B646L基因合成后连接到PUC57-simple载体上,将CP204L基因和E183L基因合成后连接到p IRES载体上。而后再通过聚合酶链式反应（PCR）扩增编码p17、p30、p54、p72蛋白的基因,并将它们分别其克隆到原核表达质粒p Cold-Ⅰ、p ET-30a或p Cold-TF载体上,所获得的重组质粒分别命名为p Cold-Ⅰ-p30、p Cold-Ⅰ-p72、p ET-30a-p54-JD和p Cold-TF-p17-JD。然后,通过His标签纯化表达的p30、p72、p54（54-185aa）和p17（61-118aa）四种重组蛋白,用这四个蛋白作为抗原免疫BALB/C小鼠制备相关蛋白的多克隆抗体。Western blotting和IFA实验结果表明所制备的多克隆抗体具有良好的反应性和特异性。2.抗ASFV p54蛋白单克隆抗体的制备及其识别的B细胞表位的鉴定将纯化的p54蛋白免疫小鼠,三免过后取效价最高的小鼠的脾细胞与SP2/0细胞进行融合,通过间接ELISA筛选出针对p54蛋白的单克隆抗体。Western blotting和IFA实验结果表明1H9抗体可以特异性识别外源性表达的p54蛋白。进一步通过分段表达p54蛋白以及Western blotting和ELISA方法鉴定,结果显示单克隆抗体1H9识别的细胞表位序列是175YTHKDLENSL184。3.针对ASFV p54蛋白抗体的间接及竞争性ELISA方法的建立用纯化的p54蛋白作为包被抗原,建立了检测ASFV抗体的间接ELISA方法。另外,用纯化的p54蛋白和针对p54蛋白的单克隆抗体成功建立了检测ASFV抗体的竞争性ELISA方法。两种方法都表现出良好的特异性和重复性。总之,本研究通过纯化ASFV p30、p72、p54和p17蛋白,以纯化的蛋白作为免疫原免疫BALB/C小鼠,获得针对相关蛋白的多克隆抗体。利用细胞融合技术制备了1株抗ASFV p54蛋白的单克隆抗体。利用纯化的p54蛋白和制备的针对p54蛋白的单克隆抗体建立的间接及竞争性ELISA方法都表现出良好的特异性和重复性。以上成果为ASFV的预防与控制提供有效的监测工具。
方翔永[7]（2021）在《中华绒螯蟹syntaxin-1蛋白多抗制备及其功能分析》文中认为中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）,为我国重要的经济蟹类,可溶性NSF附着蛋白受体（Soluble N-ethyl-maleimide Sensitive Factor Attachment Protein Receptor,SNARE）蛋白作为N-乙基马来酰胺-敏感因子（N-ethyl-maleimide Sensitive Factor,NSF）和可溶性NSF附着蛋白（soluble NSF attachment proteins,SNAP）的膜受体,而syntaxin-1蛋白属于SNARE蛋白的一种。本研究以syntaxin-1蛋白为基础,为探究SNARE蛋白家族在中华绒螯蟹精子发生过程中的表达特征和功能提供基础。获取中华绒螯蟹syntaxin-1基因转录组信息,并进行相关的生物信息学分析,克隆相应的syntaxin-1基因,并将重组后的克隆载体转入DH5α菌株中培养。结果显示,中华绒螯蟹的syntaxin-1蛋白为亲水不稳定蛋白,共有1个跨膜区段,无信号肽存在,是一种成熟蛋白,中华绒螯蟹的syntaxin-1蛋白与美洲螃蟹的syntaxin-1A蛋白具有同源性,可克隆出的syntaxin-1基因大小在250-500bp,与理论值（397bp）相符合。构建相应的表达载体syntaxin-1-p ET-30a,转入到DE3菌株中培养,并通过p ET-30a上的组氨酸标签纯化得到syntaxin-1蛋白。研究发现,纯化的蛋白大小为20-31kd之间,与理论值（21kd）相符合。以纯化后的syntaxin-1蛋白作为免疫原,制备多克隆抗体,并检测多克隆抗体效价。多克隆抗体效价检测结果显示,制备的多克隆抗体效价为1:25600,效价大于1:10000,符合抗体制备的要求。以制备的多克隆抗血清作为一抗,通过免疫荧光及免疫组化的方法,对syntaxin-1蛋白在中华绒螯蟹各种生精细胞中的定位进行分析。免疫荧光接结果表明,syntaxin-1蛋白在精原细胞、初级精母细胞和次级精母细胞中定位于细胞膜上,但在成熟精子细胞中则定位于细胞核上,且syntaxin-1在精原细胞、初级精母细胞和次级精母细胞中的分泌量依次增多,并且制备多抗组染色效果显着优于购买抗体组,同时免疫组化结果也显示该蛋白的定位情况与免疫荧光结果相一致。综上所述,本研究成功克隆了syntaxin-1基因,并通过构建相应的syntaxin-1-p ET-30a表达载体,成功合成和纯化了syntaxin-1蛋白,并以纯化出的syntaxin-1蛋白作为免疫原,制备出效价符合要求的多克隆抗体。通过免疫荧光和免疫组化方法,发现syntaxin-1蛋白在精原细胞、初级精母细胞和次级精母细胞中定位于细胞膜上,而在成熟精子中定位于细胞核上。综合免疫荧光与免疫组化结果,可推测syntaxin-1蛋白主要在精子发生后期发挥作用,其功能主要在于完成精子顶体反应,且在形成成熟精子后SNARE复合体解体,syntaxin-1蛋白转移入核。
郭军培[8]（2021）在《猪GRP多克隆抗体的制备与应用及其对Leydig cells睾酮分泌的影响》文中提出胃泌素释放肽（Gastrin-releasingpeptide,GRP）是1979年从猪的胃组织中分离得到的一种神经肽,是哺乳动物蛙皮素样肽家族中的一员,在体内GRP通过与其受体（Gastrin-releasing peptide receptor,GRPR）结合发挥多种生理功能。GRP及其受体在多种动物的神经系统和外周组织中广泛表达,参与调控体内多种生物学作用,包括:促进正常/肿瘤细胞的增殖分化、促进胰液分泌、调节应激和恐惧等情绪性行为、参与调控摄食和节律等。自GRP发现以来,目前大多数关于GRP及其受体功能的研究都集中于人和大小鼠上,关于猪体内GRP的表达及其生物学作用的研究较缺乏。为研究GRP在猪体内的分布情况,我们首先制备了猪GRP多克隆抗体,并研究了GRP蛋白在猪体内的分布。本课题组前期研究结果表明,GRP可能对公猪的生殖功能具有调控作用,因此本试验以猪Leydig cells为模型,研究GRP对猪Leydig cells睾酮分泌/合成、增殖及凋亡的影响。通过以上研究旨在发现GPR在猪体内可能存在的生理功能及对猪Leydig cells的影响,为进一步研究GRP对公猪生殖相关激素的调控机制奠定基础。1.猪GRP多克隆抗体的制备本试验通过大肠杆菌原核表达技术,构建了重组表达载体pET32a（+）-pGRP,并转化到表达菌株BL21（DE3）获得pGRP融合蛋白表达菌株,IPTG诱导表达菌株获得Histag-pGRP融合蛋白,以纯化后的融合蛋白为免疫原,制定免疫程序免疫试验动物后获得抗血清,即为制备的多克隆抗体。具体如下:（1）根据猪GRP基因序列,设计并合成添加酶切位点的引物序列;通过PCR扩增获得pGRP目的片段,包括全长开放阅读框（441 bp）,编码146个氨基酸;随后与pMD19T连接构建pMD19T-pGRP重组质粒;将pMD19T-pGRP和pET32a（+）质粒经双酶切线性化后连接构建pET32a（+）-pGRP重组表达载体;并转化至表达菌株BL21（DE3）中获得BL21（DE3）-pET32a（+）-pGRP融合蛋白表达菌株。（2）利用IPTG诱导BL21（DE3）-pET32a（+）-pGRP融合蛋白表达菌株获得His-tag-pGRP融合蛋白,并对获得的蛋白进行检测和纯化。（3）制定免疫程序后,以纯化后的融合蛋白为免疫原免疫试验动物家兔,并获得抗血清;采用ELISA检测抗血清的效价为1:50,000,并通过Western Blot检测抗血清的反应原性;纯化后的抗血清即为制备的多克隆抗体。2.GRP在猪体内的分布定位和表达本部分主要通过IHC和Western Blot检测GRP蛋白在猪组织中的分布表达情况。结果表明:GRP蛋白在猪的中枢神经系统和外周组织器官中都有表达,其中在中枢神经系统GRP蛋白主要表达在下丘脑、小脑等组织;在外周组织中主要表达在胃肠道和泌尿生殖道。综上所述,GRP蛋白在猪体内的广泛存在表明GRP可能对猪的多种生理功能具有调节作用。3.GRP对猪Leydigcells的影响为研究GRP对猪Leydig cells的影响,我们使用一定浓度的GRP处理猪Leydig cells,收集上清和蛋白样品分别进行如下检测:检测GRPR蛋白在Leydig cells中表达,结果表明一定浓度（1和10 nM）的GRP可以显着促进GRPR蛋白的表达;检测上清中睾酮分泌和睾酮合成相关蛋白（StAR、CYP11A1和HSD3B2）表达的影响,结果表明GRP能够促进睾酮的分泌,其中1和10nM的GRP能够显着增加睾酮的浓度（P<0.01和P<0.05）;Western Blot结果也表明不同浓度GRP处理细胞对睾酮合成相关蛋白（StAR、CYP11A1和HSD3B2）的表达有一定的促进作用;进一步检测了GRP对Leydig cells细胞增殖和凋亡的影响,CCK-8结果表明GRP对细胞活性有一定的作用,GRP浓度为1和10nM时能够显着增加细胞数量（P<0.01和P<0.05）;Western Blot检测结果表明一定浓度的GRP对Cyclin B1蛋白表达有促进作用,但是对PCNA影响不显着;同时流式细胞术检测结果表明一定剂量的GRP能够促进细胞凋亡并促进凋亡相关蛋白的表达;检测了GRP处理对G-蛋白偶联受体信号通路中pPKC/PKC和pPKA/PKA蛋白表达的影响,结果显示一定浓度的GRP能够增加pPKC/PKC的比值,但是对pPKA/PKA的比值影响不显着。该论文构建重组表达载体pET32a（+）-pGRP并制备猪GRP多克隆抗体,通过IHC和Western Blot检测GRP蛋白猪体内的分布和表达情况,结果表明GRP蛋白在猪组织中具有广泛的分布表达,表明GRP在猪体内可能具有多种生理功能。该论文进一步研究GRP对猪睾丸间质细胞睾酮的分泌和合成的影响,结果表明一定浓度的GRP能够促进睾酮分泌并调节睾酮合成相关蛋白的表达;另外,研究结果还表明一定浓度的GRP对睾丸间质细胞的细胞增殖和凋亡也有影响;并发现GRP/GRPR系统对睾丸间质细胞的调节作用可能是通过pPKC/PKC途径。
王丽娜[9]（2021）在《牛坏死杆菌43K OMP抗原表位的初步筛选》文中研究表明牛坏死杆菌（Fusobacterium necrophorum）是革兰氏阴性厌氧多形性细菌,主要引起肝脓肿、腐蹄病和犊牛白喉,并在奶牛乳腺炎、子宫内膜炎的发展中起重要作用。牛坏死杆菌对宿主细胞的黏附作用是其入侵机体及致病的关键步骤,因此,明确43K OMP发挥黏附作用的主要位点及筛选相应抗原表位具有重要意义。本试验从牛坏死杆菌43K OMP与宿主细胞的黏附功能为出发点,筛选43K OMP的黏附功能区;制备其单克隆抗体,并初步确定单克隆抗体的识别位点;结合生物信息学分析技术,筛选并验证牛坏死杆菌43K OMP的抗原表位。实验首先利用原核表达系统,重组表达了四个互相重叠的牛坏死杆菌43K OMP基因截短片段,表达后的蛋白经过纯化后分别制备兔多克隆抗体,利用辛酸-饱和硫酸铵法对多克隆抗体进行粗纯,纯化后的多克隆抗体与分别与BEND、MACT细胞进行黏附抑制试验,通过革兰氏染色法和平板计数法评定4个多克隆抗体抑制黏附的效果,以初步确定43K OMP的黏附功能区;随后制备43K OMP黏附功能区的单克隆抗体,ELISA检测单克隆抗体效价、抗体亚类检测试剂盒测定其亚类、Western blot对单克隆抗体进行鉴定,并初步筛选单克隆抗体的识别表位;最后利用生物信息学技术分析43K OMP的理化性质、跨膜区、信号肽、磷酸化位点、二级结构、三级结构、亲水性、可及性、柔韧性、B细胞表位等参数,综合生物信息学分析结果选出位于黏附功能区内的抗原表位,最后将选出的预测表位肽合成,利用间接ELISA检测合成肽的反应活性、用间接免疫荧光法检测合成肽对BEND细胞和MACT细胞的黏附作用、最后用合成肽进行竞争抑制试验以验证其抑制牛坏死杆菌黏附细胞的效果。结果如下:（1）成功表达并纯化了牛坏死杆菌43K OMP基因截短片段,制备了多克隆抗体,通过多克隆抗体与BEND、MACT细胞的黏附抑制试验成功筛选出两段黏附功能区,分别是19～108aa和283～377aa;（2）成功制备了一株位于黏附功能区内的单克隆抗体,命名为1G7,其上清效价为1:3 200,腹水效价为1:104,初步鉴定其识别位点为283～306aa;（3）通过生物信息学分析技术,分析出43K OMP有34个磷酸化位点,无跨膜区,在1～20aa处有信号肽区域,预测出构象B细胞表位10个,选出4个位于黏附功能区内的线性B细胞表位并合成,具体氨基酸序列为T1（49～63aa）:VVQAPAKWKPNGSVG、T2（72～89aa）:VENKGKKATEENARKGWA、T3（286～302aa）:ETFWAWDKKDASMEEWP和T4（348～365aa）:GEYVNRENNKSTARYWRW。验证其具有较好的反应性,对BEND细胞、MACT细胞有较好的黏附作用,能竞争抑制牛坏死杆菌对BEND细胞、MACT细胞的黏附作用。本试验初步筛选出43K OMP黏附功能区,区间为19～108aa和283～377aa;成功制备了1株牛坏死杆菌43K OMP单克隆抗体命名为1G7,初步筛选出其识别表位为283～306aa;预测出牛坏死杆菌43K OMP有10个构象B细胞表位,4个位于黏附功能区内的表位肽,T1:VVQAPAKWKPNGSVG、T2:VENKGKKATEENARKGWA、T3:ETFWAWDKKDASMEEWP和T4:GEYVNRENNKSTARYWRW,经验证具有较好的免疫活性,可黏附BEND细胞和MACT细胞,能竞争抑制牛坏死杆菌对BEND细胞、MACT细胞的黏附作用。为进一步研究牛坏死杆菌的致病机理及抗菌药物的研发与设计提供了理论依据。
高阳[10]（2021）在《毒害艾美耳球虫入侵宿主细胞关键分子的筛选与鉴定及其功能研究》文中研究指明鸡球虫病是由顶复门（Apicomplexa）、艾美耳属球虫（Eimeria）寄生于鸡肠道引起的一种寄生虫病,其病原有7种,其中毒害艾美耳球虫（E.necatrix）是鸡球虫病的主要病原,主要危害8～18周龄的青年鸡,可引起鸡的急性小肠球虫病,导致育成鸡的大批死亡。近年来,随着饲养周期相对较长的黄羽鸡饲养量不断攀升,以及鸡球虫病活疫苗的使用,毒害艾美耳球虫引起的急性小肠球虫病越来越多见。目前鸡球虫病的防治主要依赖药物,但随着耐药性虫株、药物残留肉蛋、病原污染环境等问题的出现,迫切需要寻找一种有效、安全的方法来替代抗球虫药。艾美耳球虫为单宿主寄生虫,其发育经历孢子生殖、裂殖生殖和配子生殖三个阶段。孢子生殖在外界环境中进行,形成具有感染性的孢子化卵囊。裂殖生殖和配子生殖在鸡肠道上皮细胞内进行,最终形成未孢子化卵囊,并随鸡粪便排出体外。孢子化卵囊被鸡食入后,释放出孢子囊,后者在肠道中释放出子孢子。子孢子入侵肠上皮细胞,进行裂殖生殖,产出裂殖子,后者再次侵入肠上皮细胞,开始新一轮的裂殖生殖。经2～3代裂殖生殖后,裂殖子进入配子生殖。由此可见,子孢子与裂殖子入侵宿主细胞是球虫建立和完成寄生生活的关键点。鉴定与解析参与这些关键点的分子及其作用机制,将有助于发现防控鸡球虫的新策略。迄今,关于顶复门原虫入侵宿主细胞的关键分子和机制主要来源于对疟原虫（Plasmodium spp.）和弓形虫（Toxoplasma gondii）的研究,对艾美耳球虫的研究甚少。本文通过对毒害艾美耳球虫未孢子化卵囊、子孢子和第二代裂殖子转录组学和蛋白质组的比较分析,鉴定差异表达基因和差异表达蛋白,筛选虫体入侵相关分子,并选择关键基因进行原核表达和功能分析,研究结果将有助于阐明球虫入侵宿主细胞的分子机制以及发现药物治疗靶点或疫苗候选抗原。一、毒害艾美耳球虫未孢子化卵囊、子孢子和第二代裂殖子的转录组学比较研究分离纯化未孢子化卵囊（UO）、子孢子（SZ）和第二代裂殖子（MZ-2）,分别提取RNA,构建测序文库,进行高通量测序。基于PacBio平台三代全长转录组测序,UO、SZ 和 MZ-2 分别获得 9 305 110、8 423 031、6 756 870 条 Subreads,34 932、23040、21 923条转录本,4949,4254,4007个基因;UO发生3’端可变剪接基因数目最多（27.5%）,SZ 和 MZ-2 发生 5’端最多（19.09%、23.93%）;UO、SZ、MZ-2 的 mRNA3’端分别有955、797、840个基因含有单个poly-A位点;分别鉴定到1958（UO）、1743（SZ）、1416（MZ-2）个新基因,26810（UO）、17804（SZ）、17151（MZ-2）个新转录本;转录因子分析显示,UO、SZ和MZ-2分别有194、159和84条转录本支持10个、11个和8个转录因子家族;在UO、SZ、MZ-2中,分别鉴定到5223、3581、2039条长链非编码RNA,3835、4019、2588个融合转录本。基于Illumina平台二代转录组学测序,分别获得 71 298 596（UO）、73 222160（SZ）和 70203 690（MZ-2）条 Raw reads,8376（SZ vs UO）、6905（SZ vs MZ-2）和 7902（MZ-2 vs UO）个差异表达基因;GO富集分析显示,在SZ vs UO间有6237个DEGs显着富集到113条GO条目,在SZ vs MZ-2间有5076个DEGs显着富集到9条GO条目,在MZ-2 vs UO间有5833个DEGs显着富集到102条GO条目;KEGG富集分析显示,在SZ vs UO间有664个DEGs显着富集到13条信号通路,在SZ vs MZ-2间有1324个DEGs显着富集到31条信号通路,在MZ-2 vs UO间有987个DEGs显着富集到14条信号通路。筛选获得了123个差异表达基因与子孢子入侵宿主细胞相关,50个基因在SZ阶段上调表达,73个基因在UO阶段上调表达。二、毒害艾美耳球虫未孢子化卵囊、子孢子和第二代裂殖子的蛋白质组学比较研究分别提取UO、SZ、MZ-2的总蛋白,采用iTRAQ定量标记,进行蛋白质组学测序。共鉴定到983 835个二级谱图,26 410条肽段,3606个蛋白。用GO、KEGG、IPR、KOG四个数据库注释,分别获得1725、2143、2386、1724个蛋白。蛋白差异分析显示,在SZ vs UO、SZ vs MZ-2、MZ-2vs UO间分别鉴定到388、300、592个差异蛋白（DEPs）。GO富集分析,在SZ vs UO间有166个DEPs显着富集到38个GO条目,在MZ-2 vs UO间有105个DEPs显着富集到20个GO条目,在MZ-2 vs UO间有200个DEPs显着富集到11个GO条目。KEGG富集分析显示,在SZ vs UO间有89个差异蛋白显着富集到102条信号通路,在SZ vs MZ-2间有52个DEPs显着富集到72条信号通路,在MZ-2 vs UO间有105个DEPs显着富集到125条信号通路。差异表达蛋白结构域富集分析显示,在SZ vs UO间有47个DEPs富集到66个结构域,在SZ vs MZ-2间有32个DEPs富集到43个结构域,在MZ-2 vs UO间有64个DEPs富集到84个结构域。差异表达蛋白互作分析显示,在SZ vs UO间有273个蛋白686条蛋白互作反应线,在SZ vs MZ-2间有153个蛋白230条蛋白互作反应线,在MZ-2 vs UO间有321个蛋白864条蛋白互作反应线。筛选获得了 103个差异蛋白与虫体入侵相关。三、毒害艾美耳球虫未孢子化卵囊、子孢子和第二代裂殖子转录组和蛋白组联合分析基于转录组和蛋白组的联合分析结果显示,在SZ vs UO、SZ vs MZ-2、MZ-2vs UO间转录组和蛋白组表达量person关联系数分别为0.086、0.297和0.317;在mRNA水平与蛋白水平上,关联基因除表达趋势一致外还存在多种表达模式。对转录组和蛋白组相互关联的差异表达基因分析显示,在SZ vs UO、SZ vs MZ-2、MZ-2vs UO间的差异表达基因数分别为292、159和391个,这些差异表达基因富集到核酸结合、小分子结合、转移酶活性、辅因子结合、氧化还原酶活性等GO条目,参与内质网中蛋白质加工、氨酰基tRNA的生物合成、谷胱甘肽代谢、丙酸酯代谢、碳代谢、氨基酸生物合成、过氧化物酶体等信号通路。筛选获得了 68个关联的差异表达基因与虫体入侵相关。四、毒害艾美耳球虫SAG、P25和MIC13基因的原核表达及免疫荧光定位分析用RT-PCR克隆3个虫体入侵相关差异表达基因—表面抗原基因（EnSAG）、P25蛋白基因（Enp25）和微线体蛋白13基因（EnMIC13）,并用pET28a（+）载体构建重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）后诱导表达。重组蛋白rEnSAG、rEnp25和rEnMIC13 大小分别为 26 kDa、23 kDa 和 19 kDa,其中 rEnSAG 和 rEnMIC13 以包涵体形式存在,rEnp25表达于上清。重组蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化后免疫小鼠,制备鼠抗血清。Western blot检测显示,3种重组蛋白均被6 × HIS标签单抗和鼠抗血清特异性识别。用鼠抗血清检测MZ-2中天然蛋白,结果均检测到天然蛋白。免疫荧光定位结果显示,EnSAG蛋白分布在SZ和MZ-2胞质内,Enp25蛋白分布在SZ虫体一端和MZ-2胞质内,EnMIC13蛋白分布在SZ和MZ-2胞质内。实时荧光定量PCR检测显示,EnSAG基因在SZ高表达,Enp25基因在UO高表达,EnMIC13基因在MZ-2高表达。Western blot检测蛋白表达量显示,EnSAG蛋白和Enp25蛋白在SZ和MZ-2均高表达,且在MZ-2表达量最高;EnMIC13蛋白仅在MZ-2表达,但表达量相对较低。五、重组蛋白rEnSAG、rEnP25和rEnMIC13的免疫保护效果评价将3种重组蛋白分别与佐剂混合后,制备免疫原。每种蛋白分别设高、中、低（200、100、50 μg/羽）三个剂量组,同时设未免疫攻虫组（阳性对照组）和未免疫未攻虫组（阴性对照组）。二免后7d,除阴性组外,其余各试验组攻虫。以成活率、平均增重、病变记分、卵囊减少率为指标,评价重组蛋白的免疫保护效果。结果显示,rEnSAG中剂量组、rEnp25高剂量组和rEnMIC13高剂量组的免疫保护效果较好,与阳性对照组相比,免疫组的病变记分降低,卵囊产量减少,平均增重增加。
二、CML66基因的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、CML66基因的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备（论文提纲范文）
（1）K亚群禽白血病病毒gp85表面蛋白的特异基因表达及应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 禽白血病 |
| 1.1.1 ALV病原学 |
| 1.1.2 ALV流行病学 |
| 1.1.3 ALV致病性 |
| 1.1.4 ALV防控现状与存在问题 |
| 1.2 K亚群禽白血病病毒(ALV-K) |
| 1.2.1 ALV-K的发现 |
| 1.2.2 ALV-K基因结构及特点 |
| 1.2.3 ALV-K致病性及危害 |
| 1.2.4 ALV-K在我国鸡群感染现状 |
| 1.3 ALV抗体检测ELISA研究进展 |
| 1.3.1 ALV-A/B/J抗体检测ELISA研究进展 |
| 1.3.2 ALV-K抗体检测ELISA研究进展 |
| 1.3.3 ALV-K抗体检测ELISA存在的问题 |
| 1.4 ALV单克隆抗体研究进展 |
| 1.4.1 ALV-A/B/J单克隆抗体研究进展 |
| 1.4.2 ALV-K单克隆抗体研究进展 |
| 1.4.3 ALV-K单克隆抗体研究存在的问题 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 病毒、细胞、抗体和试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 ALV-K gp85 目的基因分析 |
| 2.2.2 K亚群gp85 蛋白原核表达体系的建立 |
| 2.2.3 间接ELISA检测抗体方法的建立 |
| 2.2.4 ALV-K gp85 蛋白的多克隆抗体制备 |
| 2.2.5 ALV-K gp85 蛋白的单克隆抗体制备 |
| 2.3 数据处理与统计 |
| 3 结果 |
| 3.1 ALV-K gp85 目的基因分析 |
| 3.1.1 基因序列分析 |
| 3.1.2 目的蛋白分析 |
| 3.2 ALV-K gp85 特异基因的原核表达 |
| 3.2.1 ALV-K gp85 特异基因克隆PCR产物的鉴定 |
| 3.2.2 重组表达质粒的鉴定 |
| 3.2.3 gp85 特异性蛋白的制备及鉴定 |
| 3.3 ALV-K间接ELISA检测抗体方法的建立 |
| 3.3.1 间接ELISA条件的优化 |
| 3.3.2 特异性试验 |
| 3.3.3 敏感性试验 |
| 3.3.4 重复性试验 |
| 3.3.5 符合率试验 |
| 3.3.6 保存期试验 |
| 3.4 ALV-K gp85 蛋白的多克隆抗体制备 |
| 3.4.1 多克隆抗体效价测定 |
| 3.4.2 多克隆抗体的纯化及检测鉴定 |
| 3.4.3 多克隆抗体的识别检测 |
| 3.5 ALV-K gp85 蛋白的单克隆抗体制备 |
| 3.5.1 ALV-K gp85 蛋白免疫小鼠效价测定 |
| 3.5.2 杂交瘤细胞融合观察 |
| 3.5.3 杂交瘤细胞抗体分泌鉴定 |
| 3.5.4 腹水制备鉴定及应用 |
| 4 讨论 |
| 4.1 ALV-K gp85 重组蛋白的制备 |
| 4.2 ALV-K间接ELISA检测抗体方法的建立 |
| 4.3 ALV-K多克隆抗体的制备 |
| 4.4 ALV-K单克隆抗体的制备 |
| 5 结论 |
| 6 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间取得学术成果 |
（2）EFEMP1与IZUMO1的相互作用及对受精的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略说明 |
| 第一章 EFEMP1 的研究进展 |
| 1 Fibulin家族概述 |
| 2 Fibulin家族成员概述 |
| 2.1 长Fibulin亚类 |
| 2.1.1 Fibulin-1 |
| 2.1.2 Fibulin-2 |
| 2.1.3 Fibulin-6和Fibulin-8 |
| 2.2 短Fibulin亚类 |
| 2.2.1 Fibulin-3 |
| 2.2.2 Fibulin-4 |
| 2.2.3 Fibulin-5 |
| 2.2.4 Fibulin-7 |
| 3 EFEMP1 的基本特性 |
| 3.1 EFEMP1 的结构特征 |
| 3.2 EFEMP1 的表达模式 |
| 3.3 EFEMP1 参与的蛋白质相互作用 |
| 3.3.1 EFEMP1与PDIA3 的相互作用 |
| 3.3.2 EFEMP1与TIMP-3 的相互作用 |
| 3.3.3 EFEMP1与DA41 的相互作用 |
| 3.3.4 EFEMP1 与原弹性蛋白的相互作用 |
| 3.3.5 EFEMP1与ECM1 的相互作用 |
| 3.4 efemp1 基因敲除小鼠模型 |
| 3.4.1 efemp1 基因敲除小鼠的筋膜组织异常 |
| 3.4.2 efemp1 基因敲除小鼠的角膜和Bruch膜异常 |
| 3.4.3 efemp1 基因敲除小鼠嗅觉传导通路的修复功能异常 |
| 3.5 EFEMP1 相关的人类疾病 |
| 3.5.1 腹股沟疝 |
| 3.5.2 Doyne蜂窝状视网膜营养不良 |
| 3.5.3 癌症 |
| 3.6 EFEMP1 在生殖中的作用 |
| 第二章 EFEMP1与IZUMO1 的相互作用及对受精的影响 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验菌种与细胞 |
| 2.1.3 质粒载体 |
| 2.1.4 实验仪器 |
| 2.1.5 实验试剂 |
| 2.1.6 主要溶液配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 大鼠睾丸总RNA的提取 |
| 2.2.2 大鼠睾丸组织cDNA的合成 |
| 2.2.3 大鼠睾丸组织cDNA的检测 |
| 2.2.4 大鼠efemp1 CDS全长的克隆 |
| 2.2.4.1 克隆引物的设计和合成 |
| 2.2.4.2 efemp1 CDS全长克隆 |
| 2.2.4.3 efemp1-T重组载体的构建与鉴定 |
| 2.2.4.4 重组质粒测序结果分析 |
| 2.2.5 酵母双杂实验 |
| 2.2.5.1 efemp1 酵母重组载体亚克隆引物的设计与合成 |
| 2.2.5.2 大鼠efemp1 目的片段的扩增与过渡载体的构建 |
| 2.2.5.3 pGAD-efemp1 重组载体的构建与鉴定 |
| 2.2.5.4 醋酸锂法制备酵母感受态细胞 |
| 2.2.5.5 重组载体转化酵母感受态细胞 |
| 2.2.5.6 酵母双杂交 |
| 2.2.6 免疫共沉淀实验 |
| 2.2.6.1 efemp1 真核重组载体亚克隆引物的设计与合成 |
| 2.2.6.2 pCMV-Flag-efemp1 重组载体的构建与鉴定 |
| 2.2.6.3 293 T细胞的培养 |
| 2.2.6.4 细胞共转染 |
| 2.2.6.5 磁珠法免疫沉淀转染细胞总蛋白 |
| 2.2.7 大鼠EFEMP1 的原核表达纯化及多克隆抗体制备 |
| 2.2.7.1 efemp1 原核重组载体亚克隆引物的设计与合成 |
| 2.2.7.2 pET-28a-efemp1 原核表达载体的构建与鉴定 |
| 2.2.7.3 EFEMP1-HIS融合蛋白的诱导表达 |
| 2.2.7.4 EFEMP1-HIS融合蛋白的SDS-PAGE检测 |
| 2.2.7.5 EFEMP1-HIS融合蛋白的Western blot检测 |
| 2.2.7.6 EFEMP1-HIS融合蛋白的纯化与检测 |
| 2.2.7.7 Bradford法测定纯化后EFEMP1-HIS融合蛋白的浓度 |
| 2.2.7.8 EFEMP1 抗体的制备与检测 |
| 2.2.7.9 大鼠和小鼠肺组织总蛋白对自制多克隆抗体的特异性检测 |
| 2.2.8 间接免疫荧光技术检测EFEMP1 的定位及与IZUMO1 的共定位 |
| 2.2.8.1 EFEMP1 在小鼠睾丸和卵巢中的定位 |
| 2.2.8.2 EFEMP1 在顶体反应前后大鼠精子和小鼠精子中的定位 |
| 2.2.8.3 EFEMP1和IZUMO1 在顶体反应前后大鼠精子和小鼠精子中的共定位 |
| 2.2.8.4 EFEMP1 在小鼠MII期卵母细胞中的定位 |
| 2.2.9 EFEMP1 抗体处理后小鼠精卵的体外授精观察 |
| 3 结果 |
| 3.1 大鼠efemp1的CDS序列克隆 |
| 3.1.1 大鼠睾丸组织cDNA合成产物的检测 |
| 3.1.2 大鼠efemp1 cDNA序列的克隆 |
| 3.1.3 重组载体efemp1-T的双酶切鉴定 |
| 3.2 酵母双杂交实验 |
| 3.2.1 pGAD-efemp1 重组载体的构建与鉴定 |
| 3.2.2 pGAD-efemp1 重组载体转化酵母感受态细胞的菌落PCR鉴定 |
| 3.2.3 酵母双杂交 |
| 3.2.4 营养缺陷培养基上双杂交酵母的生长状况 |
| 3.3 免疫共沉淀鉴定EFEMP1与IZUMO1 的相互作用 |
| 3.3.1 pCMV-Flag-efemp1 重组载体的构建与鉴定 |
| 3.3.2 转染后293 T细胞总蛋白的Western blot检测 |
| 3.3.3 磁珠法免疫沉淀转染细胞总蛋白 |
| 3.4 大鼠EFEMP1 的原核表达纯化及多克隆抗体制备 |
| 3.4.1 pET-28a-efemp1 重组载体的构建与鉴定 |
| 3.4.2 EFEMP1-HIS融合蛋白的诱导表达与鉴定 |
| 3.4.3 EFEMP1-HIS融合蛋白的纯化与检测 |
| 3.4.4 Bradford法测定纯化后EFEMP1-HIS融合蛋白的浓度 |
| 3.4.5 EFEMP1 抗体的制备与检测 |
| 3.4.6 大鼠和小鼠肺组织总蛋白对自制多克隆抗体的特异性检测 |
| 3.5 间接免疫荧光技术检测EFEMP1 的定位及与IZUMO1 的共定位 |
| 3.5.1 EFEMP1 在小鼠睾丸和卵巢中的定位 |
| 3.5.2 EFEMP1 在顶体反应前后大鼠和小鼠精子中的定位 |
| 3.5.3 EFEMP1和IZUMO1 在顶体反应前后大鼠和小鼠精子中的共定位 |
| 3.5.4 EEFMP1 在小鼠MII期卵母细胞中的定位 |
| 3.6 EFEMP1 抗体处理后小鼠精卵的体外授精观察 |
| 4 讨论 |
| 4.1 EFEMP1与IZUMO1 的相互作用 |
| 4.2 EFEMP1 在生殖细胞的定位及其与IZUMO1 的共定位 |
| 4.3 EFEMP1 对受精的影响 |
| 5 小结和创新点 |
| 5.1 小结 |
| 5.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录1 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间参与的科研项目和发表的论文 |
（3）牛呼吸道合胞体病毒G基因原核表达及其多克隆抗体的制备（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 牛呼吸道合胞体病毒概述 |
| 1.1.1 牛呼吸道合胞体病毒的病原特性 |
| 1.1.2 牛呼吸道合胞体病毒的主要相关蛋白 |
| 1.2 牛呼吸道合胞体病的流行病学 |
| 1.3 牛呼吸道合胞体病的临床症状与病理变化 |
| 1.4 牛呼吸道合胞体病的诊断 |
| 1.4.1 病毒分离与鉴定 |
| 1.4.2 分子生物学方法 |
| 1.4.3 血清学检测方法 |
| 1.5 牛呼吸道合胞体病疫苗研究进展 |
| 1.5.1 灭活疫苗 |
| 1.5.2 减毒活疫苗 |
| 1.5.3 亚单位疫苗 |
| 1.5.4 基因工程缺失疫苗 |
| 1.5.5 基因工程活载体疫苗 |
| 1.6 本研究的目的与意义 |
| 2 内蒙古地区牛呼吸道合胞体病毒流行病学调查 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 病料来源 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 试验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 内蒙古6 个地区BRSV阳性检出率结果 |
| 2.2.2 序列测定结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 3 牛呼吸道合胞体病毒G基因原核表达 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 样品及质粒 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 主要溶液及培养基 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 G基因主要抗原域的确定 |
| 3.2.2 引物设计及合成 |
| 3.2.3 总RNA的提取 |
| 3.2.4 反转录合成c DNA |
| 3.2.5 G基因扩增 |
| 3.2.6 胶回收目的基因 |
| 3.2.7 克隆载体的构建及鉴定 |
| 3.2.8 原核表达载体的构建及鉴定 |
| 3.2.9 重组蛋白的可溶性分析 |
| 3.2.10 重组蛋白最佳诱导条件的优化 |
| 3.2.11 重组蛋白纯化 |
| 3.2.12 重组蛋白的浓缩 |
| 3.2.13 重组蛋白West-blot检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 G基因主要抗原域确定 |
| 3.3.2 G基因扩增结果 |
| 3.3.3 G基因重组克隆载体的构建与鉴定 |
| 3.3.4 G基因重组表达载体的构建及鉴定 |
| 3.3.5 重组质粒p ET-32a-G测序结果 |
| 3.3.6 重组蛋白的诱导表达及可溶性分析 |
| 3.3.7 重组蛋白最佳诱导条件的确定结果 |
| 3.3.8 重组蛋白的纯化 |
| 3.3.9 重组蛋白Western-blot鉴定 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 多克隆抗体的制备及鉴定 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 试验动物 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要溶液 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 重组蛋白的蛋白定量 |
| 4.2.2 重组蛋白的乳化 |
| 4.2.3 小鼠的免疫及多克隆抗体制备 |
| 4.2.4 Western-Blot检测 |
| 4.2.5 间接ELISA方法检测血清抗体效价 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 重组蛋白的蛋白定量 |
| 4.3.2 Western-Blot检测结果 |
| 4.3.3 抗原最佳包被量和血清最佳稀释倍数的确定结果 |
| 4.3.4 血清抗体效价测定结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（4）嗜水气单胞菌胁迫下东北林蛙MHCI基因表达的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 主要组织相容性复合体概述 |
| 1.1.1 主要组织相容性复合体的遗传特征 |
| 1.1.2 主要组织相容性抗原的结构及功能 |
| 1.2 MHC的研究 |
| 1.2.1 哺乳类MHC的研究 |
| 1.2.2 爬行类MHC的研究 |
| 1.2.3 禽类MHC的研究 |
| 1.2.4 鱼类MHC的研究 |
| 1.2.5 两栖类MHC的研究 |
| 1.3 东北林蛙和黑龙江林蛙的研究现状 |
| 1.3.1 分布及地位 |
| 1.3.2 研究价值 |
| 1.3.3 抗病研究 |
| 1.4 研究的目的及意义 |
| 1.5 技术路线 |
| 第2章 东北林蛙和黑龙江林蛙MHCIα基因的克隆及生物信息学分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 载体、菌株及相对分子质量 |
| 2.1.3 引物设计及片段命名 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.1.5 主要生化试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 总RNA的提取 |
| 2.2.1.1 RNA的提取 |
| 2.2.1.2 RNA的检测 |
| 2.2.2 RT-PCR扩增MHCIα基因 |
| 2.2.3 连接、转化及鉴定 |
| 2.2.3.1 PCR产物的胶回收 |
| 2.2.3.2 目的片段与pMD18-T载体的连接 |
| 2.2.3.3 重组质粒的转化 |
| 2.2.3.4 重组质粒的菌落PCR鉴定 |
| 2.2.3.5 重组质粒pMD18-T-RdMHCIα-A的酶切鉴定 |
| 2.2.4 目的基因的生物信息学分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 肌肉组织总RNA的检测 |
| 2.3.2 MHCIα基因RT-PCR检测 |
| 2.3.3 MHCIα基因的生物信息学分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 东北林蛙MHCIα1+α2 肽结合区原核表达及多克隆抗体的制备 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 载体及菌株及相对分子质量标准 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 引物设计 |
| 3.1.5 主要仪器设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 目的片段和原核表达载体的制备 |
| 3.2.2 连接和转化 |
| 3.2.3 重组表达质粒pET-32a-MHCIα1+α2 的鉴定 |
| 3.2.4 东北林蛙MHCIα1+α2 肽结合区的抗原表位分析 |
| 3.2.5 目的基因在大肠杆菌中的诱导表达及纯化 |
| 3.2.6 抗血清的制备及检测 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 重组表达载体的鉴定 |
| 3.3.2 东北林蛙MHCIα1+α2 肽结合区抗原表位预测 |
| 3.3.3 表达产物的SDS-PAGE检测 |
| 3.3.4 多克隆抗体效价检测 |
| 3.3.5 表达产物的Western Blot检测 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 嗜水气单胞菌和LPS胁迫下东北林蛙和黑龙江林蛙MHCI基因的组织表达 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物炎症模型的建立 |
| 4.1.2 引物设计 |
| 4.1.3 主要生化试剂 |
| 4.1.4 主要仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 东北林蛙病理组织切片的制备 |
| 4.2.2 不同组织RNA的提取及反转录 |
| 4.2.3 qRT-PCR扩增东北林蛙和黑龙江林蛙MHCI基因 |
| 4.2.4 免疫组织化学检测东北林蛙MHCI基因 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 东北林蛙病理学变化 |
| 4.3.2 Ah和 LPS胁迫下东北林蛙和黑龙江林蛙MHCI转录水平的检测 |
| 4.3.3 Ah和 LPS胁迫下东北林蛙MHCI分子水平的检测 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表学术论文 |
| 致谢 |
（5）基于羊巴贝斯虫球状体蛋白3（SBP3）基因的检测方法建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 巴贝斯虫病概述 |
| 1.1.1 病原 |
| 1.1.2 巴贝斯虫病临床特征与治疗 |
| 1.1.3 中国羊巴贝斯虫病概况及流行病学 |
| 1.2 巴贝斯虫病诊断技术研究进展 |
| 1.2.1 病原学检查技术 |
| 1.2.2 血清学检测 |
| 1.2.3 分子生物学检测 |
| 1.3 球状体蛋白研究进展 |
| 1.3.1 顶复门原虫入侵过程 |
| 1.3.2 巴贝斯虫膜表面相关蛋白研究概况 |
| 1.4 研究目的和意义 |
| 第二章 我国羊巴贝斯虫SBP3 基因克隆与生物信息学分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 DNA 的提取及cDNA 的制备 |
| 2.2.2 pBluescriptⅡ SK(+)载体的线性化 |
| 2.2.3 引物设计 |
| 2.2.4 SBP3 基因的扩增 |
| 2.2.5 SBP3 基因与pBluescriptⅡ SK(+)载体的连接和转化 |
| 2.2.6 羊巴贝斯虫SBP3 基因序列分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 羊巴贝斯虫SBP3 基因的扩增 |
| 2.3.2 羊巴贝斯虫SBP3 基因序列分析 |
| 2.3.3 基于巴贝斯虫SBP3 的遗传进化树构建 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 基于SBP3 基因的分子检测方法的建立 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要仪器 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 基因组DNA |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 引物的设计 |
| 3.2.2 荧光定量PCR条件优化及标准曲线的建立 |
| 3.2.3 巢式PCR反应体系及反应条件的优化 |
| 3.2.4 HRM的标准样品分析 |
| 3.2.5 三种分子检测方法的特异性评价 |
| 3.2.6 三种分子检测方法的敏感性评价 |
| 3.2.7 三种分子检测方法的重复性验证 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 荧光定量PCR条件优化及标准曲线的绘制 |
| 3.3.2 巢式PCR扩增 |
| 3.3.3 巢式PCR反应的优化 |
| 3.3.4 HRM的标准样品分析结果 |
| 3.3.5 三种分子检测方法的特异性评价 |
| 3.3.6 三种分子检测方法的敏感性评价 |
| 3.3.7 三种分子检测方法的重复性验证 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 球状体蛋白3 的原核表达及多克隆抗体的制备 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 主要仪器 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 试验动物 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 羊巴贝斯虫SBP3 蛋白特性分析 |
| 4.2.2 引物的设计与合成 |
| 4.2.3 pET-28a表达载体的线性化 |
| 4.2.4 SBP3 基因的扩增 |
| 4.2.5 pET-28a-BXJSBP3 原核表达载体的构建 |
| 4.2.6 重组SBP3 蛋白的诱导表达 |
| 4.2.7 重组SBP3 蛋白的纯化及浓度测定 |
| 4.2.8 动物免疫 |
| 4.2.9 多克隆抗体的Western blot分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 羊巴贝斯虫SBP3 蛋白特性分析 |
| 4.3.2 基因的扩增及原核表达载体的构建 |
| 4.3.3 重组SBP3 蛋白的表达纯化 |
| 4.3.4 多克隆抗体的Western blot分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录A |
| 附录B |
| 附录C |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（6）ASFV免疫保护相关抗原的抗体制备及应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 非洲猪瘟的病原学 |
| 1.1.1 非洲猪瘟病毒的形态与结构 |
| 1.1.2 非洲猪瘟病毒的感染和复制 |
| 1.1.3 非洲猪瘟病毒编码的主要蛋白及功能 |
| 1.2 非洲猪瘟的流行病学 |
| 1.2.1 非洲猪瘟的国际流行概况 |
| 1.2.2 非洲猪瘟的国内流行概况 |
| 1.2.3 非洲猪瘟的传播源和传播途径 |
| 1.3 非洲猪瘟感染后的症状 |
| 1.4 非洲猪瘟的诊断方法 |
| 1.4.1 非洲猪瘟的临床诊断方法 |
| 1.4.2 非洲猪瘟的实验室诊断方法 |
| 1.5 非洲猪瘟的疫苗研究进展 |
| 1.6 可行性分析 |
| 1.7 研究目的与意义 |
| 第二章 ASFV p17、p30、p54和p72 蛋白的多克隆抗体制备 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞、质粒、菌株及实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要溶液和培养基的配置 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 抗原表位预测 |
| 2.2.2 引物设计 |
| 2.2.3 基因扩增 |
| 2.2.4 相关质粒的构建 |
| 2.2.5 重组蛋白His-p17、His-p30、His-p54和His-p72 的原核表达 |
| 2.2.6 重组蛋白His-p17、His-p30、His-p54和His-p72 的纯化 |
| 2.2.7 免疫小鼠 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 P54 蛋白优势抗原表位的选择 |
| 2.3.2 ASFV p17、p30、p54和p72 蛋白的PCR扩增及重组质粒的构建 |
| 2.3.3 ASFV p17、p30、p54和p72 蛋白的原核表达及纯化 |
| 2.3.4 Western blotting分析p17、p30、p54和p72 蛋白的多克隆抗体 |
| 2.3.5 间接免疫荧光实验分析p17、p30、p54 和p72 蛋白的多克隆抗体 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 ASFV p54 蛋白单克隆抗体制备及其表位的鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 细胞及实验动物 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要溶液和培养基的配置 |
| 3.1.4 细胞融合 |
| 3.1.5 阳性杂交瘤细胞的筛选 |
| 3.1.6 杂交瘤细胞腹水的制备 |
| 3.1.7 单克隆抗体的特异性检测 |
| 3.1.8 单克隆抗体亚型鉴定 |
| 3.1.9 单克隆抗体识别表位的筛选与鉴定 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 p54 蛋白单克隆抗体的特异性检测 |
| 3.2.2 单克隆抗体亚型鉴定 |
| 3.2.3 单克隆抗体识别的抗原表位鉴定 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 基于p54 蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 主要材料与试剂 |
| 4.1.2 主要溶液的配置 |
| 4.1.3 基于p54 蛋白间接ELISA抗体检测方法 |
| 4.1.4 间接ELISA检测方法临界值的测试 |
| 4.1.5 间接ELISA检测方法血清特异性测试 |
| 4.1.6 间接ELISA检测方法血清敏感性测试 |
| 4.1.7 间接ELISA检测方法符合率实验 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 基于p54 蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立 |
| 4.2.2 间接ELISA检测方法特异性测试结果 |
| 4.2.3 间接 ELISA 检测方法血清敏感性测试结果 |
| 4.2.4 间接 ELISA 检测方法符合率 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 基于p54 蛋白竞争性ELISA抗体检测方法的建立 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 主要材料与试剂 |
| 5.1.2 主要溶液的配置 |
| 5.1.3 基于p54 蛋白竞争性ELISA抗体检测方法 |
| 5.1.4 竞争ELISA检测方法临界值的测试 |
| 5.1.5 竞争ELISA检测方法符合率分析 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.2.1 基于p54 蛋白竞争性ELISA抗体检测方法的建立 |
| 5.2.2 竞争ELISA检测方法临界值的确定 |
| 5.2.3 竞争 ELISA 检测方法符合率 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（7）中华绒螯蟹syntaxin-1蛋白多抗制备及其功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 SNARE蛋白简介 |
| 1.1.1 SNARE蛋白结构及分类 |
| 1.1.2 SNARE蛋白功能——介导囊泡运输 |
| 1.2 SNARE蛋白常见功能简介 |
| 1.2.1 SNARE蛋白与生殖细胞 |
| 1.2.2 SNARE蛋白与顶体反应 |
| 1.2.3 SNARE蛋白与神经递质传递 |
| 1.3 中华绒螯蟹 |
| 1.3.1 中华绒螯蟹精子发生 |
| 1.3.2 中华绒螯蟹顶体反应 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 1.5 创新点 |
| 第二章 中华绒螯蟹syntaxin-1 蛋白基因克隆 |
| 2.1 实验材料与仪器 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 主要试剂与配方 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 syntaxin-1 基因生物信息学分析 |
| 2.2.2 精巢总RNA提取 |
| 2.2.3 紫外分光光度法检测总RNA浓度及纯度 |
| 2.2.4 1%琼脂糖凝胶分离总RNA |
| 2.2.5 精巢总c DNA反转录 |
| 2.2.6 RT-PCR合成syntaxin-1 基因 |
| 2.2.7 1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物 |
| 2.2.8 回收PCR产物 |
| 2.2.9 表达syntaxin-1 基因及测序 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 syntaxin-1 基因生物信息分析结果 |
| 2.3.2 精巢总RNA提取结果 |
| 2.3.3 syntaxin-1 PCR扩增结果 |
| 2.3.4 syntaxin-1 阳性克隆菌液PCR鉴定结果 |
| 2.3.5 Syntaxin-1 基因测序结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 syntaxin-1 蛋白的生物信息学分析 |
| 2.4.2 中华绒螯蟹精巢总RNA提取 |
| 2.4.3 syntaxin-1 基因的PCR扩增 |
| 2.4.4 syntaxin-1 阳性克隆菌液PCR |
| 第三章 中华绒螯蟹syntaxin-1 蛋白的原核表达与纯化 |
| 3.1 实验材料与仪器 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验试剂与配方 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 构建表达载体 |
| 3.2.2 syntaxin-1 蛋白原核表达 |
| 3.2.3 syntaxin-1 蛋白纯化 |
| 3.2.4 纯化蛋白的质谱检测 |
| 3.2.5 BCA法测目的蛋白浓度 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 克隆带双酶切位点syntaxin-1 基因 |
| 3.3.2 syntaxin-1 基因酶切后产物 |
| 3.3.3 p ET-30a表达载体双酶切产物 |
| 3.3.4 重组质粒酶切后产物 |
| 3.3.5 原核表达检测结果 |
| 3.3.6 Syntaxin-1-p ET-30a 表达载体测序结果 |
| 3.3.7 蛋白原核表达结果 |
| 3.3.8 蛋白纯化结果 |
| 3.3.9 质谱一级结构 |
| 3.3.10 质谱二级结构 |
| 3.3.11 BCA法测定syntaxin-1 蛋白浓度结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 构建表达载体 |
| 3.4.2 镍柱纯化目的蛋白 |
| 3.4.3 质谱一级结构分析 |
| 3.4.4 质谱二级结构分析 |
| 3.4.5 BCA法描绘回归曲线 |
| 第四章 中华绒螯蟹syntaxin-1 多克隆抗体制备 |
| 4.1 实验材料与试剂 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 主要试剂及配方 |
| 4.1.3 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 免疫小鼠 |
| 4.2.2 测定小鼠抗血清效价 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 小鼠抗血清效价检测结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 小鼠免疫 |
| 4.4.2 小鼠抗血清效价检测 |
| 第五章 中华绒螯蟹syntaxin-1 蛋白在生精细胞的定位特征 |
| 5.1 实验材料与试剂 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验试剂与配方 |
| 5.1.3 实验仪器 |
| 5.2 实验步骤 |
| 5.2.1 制备石蜡切片 |
| 5.2.2 免疫荧光 |
| 5.2.3 免疫组化 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 免疫荧光结果 |
| 5.3.2 免疫组化结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 免疫荧光结果分析 |
| 5.4.2 免疫组化结果分析 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（8）猪GRP多克隆抗体的制备与应用及其对Leydig cells睾酮分泌的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 文献综述: 胃泌素释放肽及其受体与睾丸间质细胞研究进展 |
| 1 胃泌素释放肽及其受体研究进展 |
| 1.1 胃泌素释放肽及其受体的发现 |
| 1.2 胃泌素释放肽及其受体在体内的表达 |
| 1.3 胃泌素释放肽及其受体在体内的功能研究 |
| 1.4 GRP多克隆抗体的制备 |
| 2 睾丸间质细胞研究进展 |
| 2.1 睾丸间质细胞 |
| 2.2 生殖相关激素睾酮 |
| 2.3 睾丸间质细胞的增殖与凋亡 |
| 3 研究目的及意义 |
| 第1章 猪胃泌素释放肽的原核表达及其多克隆抗体的制备 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 仪器和试剂 |
| 1.2 重组载体的构建 |
| 1.3 融合蛋白pGRP的获得 |
| 1.4 多克隆抗体的制备 |
| 2 结果 |
| 2.1 pET32a(+)-pGRP重组载体的构建 |
| 2.2 His-tag-pGRP融合蛋白的获得 |
| 2.3. pGRP多克隆抗体的获得 |
| 3 讨论 |
| 第2章 GRP蛋白在猪体内的分布与表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1仪器和试剂 |
| 1.2 GRP在猪外周组织的分布情况 |
| 1.3 GRP蛋白在猪组织中的表达情况 |
| 2 结果 |
| 2.1 GRP在猪外周组织的分布情况 |
| 2.2 GRP蛋白在猪组织中的表达情况 |
| 3 讨论 |
| 第3章 GRP对猪睾丸间质细胞睾酮分泌和合成的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 仪器和试剂 |
| 1.2 细胞培养和处理 |
| 1.3 GRP对Leydig cells中GRPR表达的影响 |
| 1.4 GRP对猪Leydig cells睾酮分泌的影响 |
| 1.5 GRP对Leydig cells睾酮合成相关蛋白表达的影响 |
| 1.6 GRP对Leydig cells细胞增殖的影响 |
| 1.7 GRP对Leydig cells凋亡的影响 |
| 1.8 GRP对Leydig cells增殖和凋亡相关蛋白表达的影响 |
| 1.9 统计方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 GRPR在Leydig cells中的表达情况 |
| 2.2 GRP对猪Leydig cells睾酮分泌及睾酮合成相关蛋白的影响 |
| 2.3 GRP对猪Leydig cells细胞活性的影响 |
| 2.4 GRP对猪Leydig cells细胞凋亡的影响 |
| 2.5 GRP对猪Leydig cells中pPKA/PKA和pPKC/PKC蛋白表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（9）牛坏死杆菌43K OMP抗原表位的初步筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 坏死杆菌概述 |
| 1.1.1 坏死杆菌特性 |
| 1.1.2 毒力因子 |
| 1.1.3 牛坏死杆菌病 |
| 1.2 外膜蛋白研究进展 |
| 1.2.1 OMPs的形成 |
| 1.2.2 OMPs的功能 |
| 1.3 抗原表位研究现状 |
| 1.3.1 抗原表位分类 |
| 1.3.2 抗原表位的研究方法 |
| 1.4 目的意义 |
| 2 43K OMP黏附功能区的初步筛选 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株、动物及主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 43K OMP基因截短片段原核表达 |
| 2.2.2 多克隆抗体的制备 |
| 2.2.3 黏附抑制实验筛选黏附功能区 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 43K OMP基因截短片段原核表达载体的构建 |
| 2.3.2 43K OMP基因截短片段原核表达及纯化 |
| 2.3.3 多克隆抗体的效价检测 |
| 2.3.4 Western blot检测多克隆抗体的特异性 |
| 2.3.5 多克隆抗体的粗纯 |
| 2.3.6 黏附抑制实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 单克隆抗体的制备及其识别表位初步鉴定 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞、实验动物及主要试剂 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 单克隆抗体的制备 |
| 3.2.2 单克隆抗体的鉴定 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 间接ELISA检测方法的建立 |
| 3.3.2 杂交瘤细胞株的筛选和克隆 |
| 3.3.3 单克隆抗体的效价测定 |
| 3.3.4 单克隆抗体亚类的鉴定 |
| 3.3.5 单克隆抗体的Western blot鉴定 |
| 3.3.6 单克隆抗体识别表位的初步鉴定 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 生物信息学预测及验证 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 基因、蛋白质序列号及主要试剂 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 43K OMP生物信息学分析及表位预测 |
| 4.2.2 43K OMP预测表位的验证 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 43K OMP的理化性质分析结果 |
| 4.3.2 43K OMP的磷酸化位点、跨膜区及信号肽预测结果 |
| 4.3.3 43K OMP的亲水性、柔韧性和表面可及性结预测果 |
| 4.3.4 43K OMP的二级结构、三级结构预测结果 |
| 4.3.5 43K OMP的B细胞表位预测结果 |
| 4.3.6 预测表位肽ELISA验证结果 |
| 4.3.7 预测表位肽黏附效果验证结果 |
| 4.3.8 预测表位肽竞争抑制试验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 个人简历 |
（10）毒害艾美耳球虫入侵宿主细胞关键分子的筛选与鉴定及其功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 一、鸡球虫入侵相关分子的研究进展 |
| 1 鸡球虫病病原 |
| 2 鸡球虫入侵宿主细胞过程 |
| 3 鸡球虫入侵关键分子 |
| 二、转录组学与蛋白组学在鸡球虫病研究中的应用 |
| 1 转录组学测序技术 |
| 2 蛋白质组学测序技术 |
| 3 转录组学在鸡球虫病研究中的应用 |
| 4 蛋白质组学在鸡球虫病研究中的应用 |
| 5 本研究的目的与意义 |
| 参考文献 |
| 第一章 毒害艾美耳球虫未孢子化卵囊、子孢子和第二代裂殖子的转录组学研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 毒害艾美耳球虫未孢子化卵囊、子孢子和第二代裂殖子的蛋白质组学研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 毒害艾美耳球虫未孢子化卵囊、子孢子和第二代裂殖子转录组和蛋白组的联合分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 毒害艾美耳球虫SAG、P25和MIC13基因的原核表达及免疫荧光定位分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 重组蛋白RENSAG、RENP25和RENMIC13的免疫保护效果评价 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 附录一: 转录组筛选子孢子入侵相关基因 |
| 附录二: 蛋白组筛选入侵相关差异蛋白 |
| 附录三: 转录组和蛋白组关联分析筛选入侵相关差异基因 |
| 攻读博士期间发表文章 |
| 致谢 |
四、CML66基因的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备（论文参考文献）
- [1]K亚群禽白血病病毒gp85表面蛋白的特异基因表达及应用[D]. 王呈呈. 山东农业大学, 2021
- [2]EFEMP1与IZUMO1的相互作用及对受精的影响[D]. 张文君. 内蒙古大学, 2021(12)
- [3]牛呼吸道合胞体病毒G基因原核表达及其多克隆抗体的制备[D]. 武春霞. 内蒙古农业大学, 2021(02)
- [4]嗜水气单胞菌胁迫下东北林蛙MHCI基因表达的研究[D]. 边若菲. 哈尔滨师范大学, 2021(08)
- [5]基于羊巴贝斯虫球状体蛋白3（SBP3）基因的检测方法建立[D]. 吕照勇. 中国农业科学院, 2021(09)
- [6]ASFV免疫保护相关抗原的抗体制备及应用[D]. 曹云雷. 中国农业科学院, 2021
- [7]中华绒螯蟹syntaxin-1蛋白多抗制备及其功能分析[D]. 方翔永. 河北大学, 2021(09)
- [8]猪GRP多克隆抗体的制备与应用及其对Leydig cells睾酮分泌的影响[D]. 郭军培. 扬州大学, 2021
- [9]牛坏死杆菌43K OMP抗原表位的初步筛选[D]. 王丽娜. 黑龙江八一农垦大学, 2021(09)
- [10]毒害艾美耳球虫入侵宿主细胞关键分子的筛选与鉴定及其功能研究[D]. 高阳. 扬州大学, 2021