一、细胞外基质的构成（论文文献综述）
龚博,林骥,王彦中,钱劲[1]（2021）在《细胞骨架与细胞外基质的力学建模与分析》文中研究表明细胞和生物组织需要适应人体内复杂的力学生物学环境,一方面要被动地承受外部环境中的机械力,另一方面在组织生长、修复等生理过程中,要积极主动地产生机械力调整自身的结构和形态.细胞和生物组织的力学性质主要由细胞骨架和细胞外基质决定,它们在微观上都是生物聚合物交联形成的复杂的、各向异性的三维网络结构.这方面早期的力学研究主要集中在通过各种网络模型,理解其普遍存在的非线性响应和硬化行为.近年来随着实验方法、理论建模和计算机模拟技术的大幅进步,这些生命介质的力学性质及其潜在的力学机理得到了更深入的理解.该文回顾了近些年细胞骨架和细胞外基质研究方面取得的部分进展,主要侧重动态交联属性、生物聚合物力学化学耦合赋予的主动材料属性、交联网络塑性和断裂,以及力学训练引发的自适应网络重构.发展细胞骨架与细胞外基质的力学模型与计算方法,分析该类生命介质的复杂力学行为,理解这些力学行为的潜在机制,可以加深人们对细胞和组织的力学生物学认识,并为人造生物材料和细胞组织工程提供基础和参考.
王宝剑[2]（2021）在《基于“阳化气，阴成形”理论研究TGF-β1/Smads影响黄韧带肥厚的机制及模型的建立》文中研究说明黄韧带肥厚（Ligamentum flavum hypertrophy,LFH）是退行性腰椎管狭窄症（Degenerative Lumbar Spinal Stenosis,DLSS）的主要病理表现之一。黄韧带（ligamentum flavum,LF）位于上、下椎板之间,从颈椎延伸至骶椎,起到保护和稳定脊柱的作用。黄韧带在纤维化过程中一方面是其自身体积发生增厚的改变,另一方面是其自身弹性的下降在脊柱后伸时出现皱褶、折叠,使椎管容积减小,导致马尾神经、神经根的受压和缺血缺氧。与此同时,肥厚黄韧带中增多的炎性介质会透过硬脊膜而扩撒至神经根,易造成神经根的炎症及水肿。另外,炎性介质还可以激活多种纤维化因子的表达而加速纤维化的进程。因此黄韧带炎症与纤维化的病理改变共同参与、相互影响而导致了 DLSS腰腿痛、间歇性跛行的症状。在退行性脊柱疾病的促炎细胞因子中,IL-1β、TNF-α是最主要的参与者,其在肥厚黄韧带中的高表达已得到初步证实,另外TGF-β 1/Smads被认为是引起纤维化的最重要的信号传导通路,它在各种组织与器官的纤维化和瘢痕组织纤维性修复过程中有着核心的推动作用。但目前关于黄韧带炎性或纤维化信号通路的研究较少。至于Smads通路是否可以介导TGF-β1致使细胞外基质沉积而导致黄韧带的肥厚,以及IL-1β、TNF-α和TGF-β 1/Smads通路中的相关原件与黄韧带厚度、纤维化程度的具体相关性尚未见报道。而在中医机制方面,“阳化气,阴成形”理论对黄韧带肥厚的病机阐明具有重要指导作用,该理论与现代医学“炎症-纤维化”的病理机制相契合。但目前尚无从该角度探讨黄韧带肥厚的报道。黄韧带肥厚动物模型的建立是研究退行性脊柱疾病的基础,也是探索黄韧带增厚机制、发现药物潜在治疗靶点的前提。但极少数研究涉及腰椎黄韧带肥厚动物模型的制作,对于该动物模型目前仍存在争议。实验一基于“阳化气,阴成形”理论研究IL-1β、TNF-α和TGF-β1/Smads在LFH中的表达及相关性目的:通过对比增厚黄韧带与未增厚黄韧带的纤维化程度以及IL-1β、TNF-α和TGF-β 1/Smads通路相关原件的表达水平,探索黄韧带厚度与纤维化程度和以上原件表达的具体相关性,初步证实Smads通路可以介导TGF-β1致使细胞外基质沉积而导致黄韧带肥厚。从“阳化气,阴成形”理论角度阐述黄韧带肥厚的中医病机,以期为中医药干预黄韧带“炎症-纤维化”病理过程提供理论支持。方法:（1）在取得医学伦理批准和患者知情同意的前提下,在临床手术中收集废弃的DLSS组增厚黄韧带和腰椎间盘突出症（Lumbar disc herniation,LDH）组未增厚黄韧带,各25例。（2）通过MRI测量两组黄韧带的厚度并对比其差异。（3）对两组标本组织进行HE染色组织学观察。（4）进行Masson三色法染色后,通过纤维化分级标准以及弹性纤维-胶原纤维比值来对比两组黄韧带总体与各层（腹侧层、中间层、背侧层）纤维化程度的差异。（5）免疫组化法检测两组黄韧带IL-1β、TNF-α、TGF-β 1/Smads（TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7）、collagen Ⅰ（Col 1）、collagen Ⅲ（Col 3）的定位、半定量表达。（6）Real-Time PCR 法检测两组黄韧带 IL-1β、TNF-α、TGF-β1/Smads（TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7）、Col1 和 Col 3 mRNA 的定量表达。（7）相关性研究:通过pearson相关与线性回归分析明确DLSS组黄韧带的厚度与其各层纤维化程度、mRNA表达的具体相关性。结果:（1）DLSS 组的黄韧带厚度为 5.13±0.80mm,大于 LDH 组 3.52±0.67mm（p<0.01）。（2）HE染色下,LDH组的未增厚黄韧带弹性纤维呈直线状,排列紧密且整齐,表面光滑连续,以弹性纤维为主,含有少量胶原纤维,细胞数目较少。DLSS组增厚的黄韧带纤维呈波浪状,排列紊乱、疏松,弹性纤维减少,胶原纤维含量增加,成纤维细胞增多。（3）DLSS组的总体纤维化分级为2.44±0.31级,高于LDH组的1.62±0.22级（p<0.05）;DLSS组腹侧层、中间层、背侧层的纤维化分级均高于LDH组（p<0.05或p<0.01或p<0.001）;DLSS组腹侧层、中间层、背侧层的纤维化分级是逐渐递增的,即腹侧层<中间层<背侧层（p<0.05或p<0.01）;DLSS组的弹性纤维-胶原纤维面积比值为1.85±0.54,低于LDH组的2.92±0.37（p<0.01）;DLSS组腹侧层、中间层、背侧层的弹性-胶原纤维比值均低于LDH组（p<0.05或p<0.01）;DLSS组腹侧层、中间层、背侧层的弹性-胶原纤维比值是逐渐递减的,即腹侧层>中间层>背侧层（p<0.05或p<0.01）。（4）免疫组化:DLSS 组的 IL-1 β、TNF-α、TGF-β 1、p-Smad2/3、Col 1和Col 3的蛋白表达均高于LDH组（p<0.05或p<0.01或p<0.001）。DLSS组的Smad7的蛋白表达低于LDH组（p<0.01）。（5）Real-Time PCR:DLSS 组 IL-1β、TNF-α、TGF-β1、Smad2、Smad3、Col 1 和 Col 3 的 mRNA 表达高于 LDH 组（p<0.05 或 p<0.01 或 p<0.001）。DLSS 组 Smad7 的 mRNA 表达低于 LDH 组（p<0.05）;DLSS 组的 IL-1β、TGF-β1、Smad2、Smad3、Col 1和Col 3的mRNA表达在背侧层最高,腹侧层最低,有从背侧层向腹侧层逐渐递减的趋势。Smad7的mRNA表达在背侧层最低,腹侧层最高,有从背侧层向腹侧层逐渐递增的趋势。（6）在DLSS组中,黄韧带腹侧层、中间层以及背侧层的纤维化分级随着黄韧带的厚度的增加而升高。各层的相关系数r分别为0.54,0.73,0.84,说明黄韧带的厚度与背侧层纤维化分级的相关程度最高。黄韧带腹侧层、中间层以及背侧层的弹性纤维-胶原纤维比随着黄韧带的厚度的增加而降低。各层的相关系数r分别为-0.62,-0.72,-0.81,说明黄韧带的厚度与背侧层弹性-胶原纤维比值的相关程度最高。（7）在DLSS组中,黄韧带厚度与背侧层TGF-β 1 mRNA表达的相关程度最高,其次依次为IL-1 β、Col 1等;黄韧带厚度与中间层IL-1 β mRNA表达的相关程度最高,其次依次为Smad7、TGF-β 1等;黄韧带厚度与腹侧层TGF-β 1 mRNA表达的相关程度最高,其次依次为为IL-1 β、Col 3等。结论:（1）相较于未增厚黄韧带,肥厚黄韧带中TGF-β1、Smad2、Smad3（或p-Smad2/3）、Col 1和Col3的mRNA和蛋白均呈高表达,Smad7的mRNA和蛋白呈低表达。初步证实Smads通路可以介导TGF-β1致使细胞外基质沉积而导致黄韧带肥厚。（2）在肥厚黄韧带中,背侧层的纤维化程度大于中间层和腹侧层。其厚度也与各层的纤维化程度呈正线性相关,且以背侧层相关性最高,中间层次之,最后是腹侧层。在肥厚黄韧带中,IL-1β、TNF-α、TGF-β1、Smad2、Smad3、Col 1和Col 3 mRNA表达均高于中间层和腹侧层,Smad7 mRNA表达低于中间层和腹侧层。其厚度也与各层的mRNA表达呈正线性（或负线性）相关,且以背侧层相关性最高,中间层次之,最后是腹侧层。说明黄韧带炎症与纤维化的严重程度由背侧向腹侧逐渐递减,其病理改变可由背侧向腹侧逐渐发展。（3）结合“阳化气,阴成形”理论认为,黄韧带在增龄、急性创伤、慢性劳损等因素作用下易出现微损伤,并诱导了局部炎症反应,当机体处于“阴平阳秘”的生理状态时,这种损伤尚能引发适度的炎症反应,以及正常的纤维化修复和瘢痕的形成,而当机体处于阴阳失衡、阳不化气状态时,持续的炎症反应使细胞因子、趋化因子等代谢产物长期聚集于黄韧带局部,形成了炎症微环境,从而诱发了过度的纤维化修复和瘢痕的形成。该中医理论与现代医学中炎症反应诱发过度的纤维化修复和瘢痕形成的理论相类似。实验二基于三种造模方法诱导大鼠黄韧带肥厚动物模型的建立与评价目的:建立一种新的黄韧带肥厚大鼠模型,并将其与人肥厚黄韧带组织进行比较、评估。同时,探讨腰椎活动范围的增加所诱发黄韧带增厚的机制。方法:（1）将72只大鼠分为A假手术组（切开皮肤等组织后缝合）、B肌肉切除组（切除L5-L6椎旁肌肉）、C骨关节切除组（切除L5-L6棘突和棘上韧带,磨除L5/6双侧关节突关节的一半,关节囊不做缝合处理）以及D肌肉+骨关节切除组（B+C混合）共4组,于造模后的4w、8w、12w共3个时间点取材。（2）通过对黄韧带的HE染色和Masson染色,测量L5/6节段黄韧带总体和背侧层的厚度以及弹性纤维-胶原纤维的比值。（3）通过X线片测量屈曲和背伸位时L5/6节段的活动范围和椎间隙高度。（4）通过免疫组化、免疫印迹、Real-Time PCR法检测黄韧带中炎性因子(IL-1β、TNF-α、TGF-β1/Smads通路相关原件和Col 1、Col 3的表达。（5）将大鼠黄韧带与人肥厚黄韧带的退变程度进行比较、评估。结果:（1）HE染色与黄韧带厚度的测量:三种造模方法均可以引起黄韧带厚度的增加,其中以肌肉+骨关节切除法最明显,其次为骨关节切除法,最后为肌肉切除法。12w时肌肉+骨关节切除组黄韧带的整体厚度是假手术组的1.35倍,骨关节切除组是假手术组的1.14倍,肌肉切除组是假手术组的1.06倍。但三种造模方法均不能引起黄韧带宽度的额外增加。12w时肌肉+骨关节切除组黄韧带背侧层厚度是假手术组的2.09倍,骨关节切除组是假手术组的1.26倍,肌肉切除组是假手术组的0.96倍。三种造模方法中只有骨关节切除法和肌肉+骨关节切除法可以引起黄韧带背侧层厚度及其所占比例的增加,其中以肌肉+骨关节切除法最为明显,其次为骨关节切除法。（2）Masson染色与纤维化程度:三种造模方法均可以引起黄韧带的弹性-胶原纤维比值的下降,其中以肌肉+骨关节切除法最为明显,其次为骨关节切除法,最后为肌肉切除法。12w时肌肉+骨关节切除组黄韧带的弹性-胶原纤维比是假手术组的0.43倍,骨关节切除组是假手术组的0.66倍,肌肉切除组是假手术组的0.95倍。（3）影像学测量:三种造模方法均可以造成屈曲位椎间隙后方高度和活动范围的增加,其中以肌肉+骨关节切除法最明显,骨关节切除法次之,最后是肌肉切除法。（4）免疫组化、免疫印迹、Real-Time PCR:①免疫组化结果显示,肌肉+骨关节切除组所产生的 IL-1 β、TNF-α、TGF-β 1、p-smad2/3、Col 1 和 Col 3的蛋白表达量最多,Smad7的表达量最少,其次为骨关节切除法,最后为肌肉切除法;②免疫印迹结果显示,肌肉+骨关节切除组所产生的IL-1 β、TNF-α、TGF-β1和Col 1的蛋白表达量最多,其次为骨关节切除法,最后为肌肉切除法;③Real-Time PCR结果显示,肌肉+骨关节切除组所产生的IL-1 β、TNF-α、TGF-β1、Smad2、Smad3、Col1和Col 3的mRNA表达量最多,其次为骨关节切除法,最后为肌肉切除法。（5）造模术后12w时假手术组的弹性-胶原纤维的比值为2.79,将其与实验一中数据比较,其退变程度类似于人未增厚的黄韧带（2.92）;肌肉切除组的弹性-胶原纤维的比值为2.65,退变程度仍接近人未增厚的黄韧带（2.92）;骨关节切除组的弹性-胶原纤维的比值为1.84,退变程度接近人轻度肥厚的黄韧带（1.66-2.23）;肌肉+骨关节切除组的弹性-胶原纤维的比值为1.19,退变程度与人中度肥厚的黄韧带相近（1.08-1.66）。结论:（1）建立了一种新的黄韧带肥厚大鼠模型,其退变程度可能类似于人类中度肥厚的黄韧带。（2）三种造模方法均能引起黄韧带退变与增厚,其程度依次为肌肉+骨关节切除法>骨关节切除法>肌肉切除法。（3）在大鼠模型中,黄韧带背侧层的增厚占比例最高,这可能是由于背侧层在屈曲位受到更大的应力导致的。说明机械应力可能是诱发或加速黄韧带增厚的重要因素。（4）腰椎屈曲范围的增加所引发的机械应力可导致黄韧带中炎性因子TNF-α、IL-1 β的高表达,并诱导TGF-β 1/Smads通路致使细胞外基质沉积而导致黄韧带肥厚。
陈倩苇[3]（2021）在《基于细胞与细胞外基质形态结构特征探讨离心运动性骨骼肌过度使用损伤发生机制》文中研究说明1目的:骨骼肌过度使用性损伤是常见的工作或运动性慢性骨骼-肌肉系统损伤,严重妨碍了患者的日常生活或运动员的训练比赛,因而探讨其发生机制,对于预防和治疗骨骼肌过度使用性损伤具有重要的意义。本文通过建立过度离心训练引起的骨骼肌过度使用性损伤动物模型,监控不同时相细胞及细胞外基质形态结构变化,旨在探讨骨骼肌过度使用性损伤发生过程及机制。2方法:选取72只6-8周龄的健康雄性wistar大鼠,随机分成3组,即安静组（C,n=24）、连续运动组（E,n=24）、间歇运动组（I,n=24）。大鼠适应性训练一周后,正式进行4周动物跑台离心训练（第1周:-16°、16m/min、60min;第2周:-16°、20m/min、60min;第3、4周:-16°、20m/min、90min）,连续运动组每周连续训练,共5次;间歇运动组每周隔天训练,共3次。每周末次训练36h后,分别取大鼠同侧股中肌,用于免疫组织化学测试,分别观察不同时相Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型胶原纤维浓度变化,以及细胞、细胞外基质形态结构变化特征。在第4周末次训练36h后,取大鼠同侧股中肌,分为两段,一段进行透射电子显微镜测试,观察骨骼肌超微结构变化;另一段用于扫描电子显微镜测试,观察骨骼肌胶原纤维结构变化。3结果:3.1骨骼肌细胞形态结构:（1）与C组相比,E组1-4周肌细胞横截面积均值均增加。组内比较时,2E组肌细胞横截面积均值最大,1E组肌细胞横截面积均值最小。（2）I组1-4周肌细胞横截面积均值大于C组。组内比较时,4I组肌细胞横截面积均值最大,2I组肌细胞横截面积均值最小。（3）E组与I组组间比较,4E与4I组肌细胞横截面积分布相似。3.2Ⅳ型胶原纤维浓度与基底膜厚度:（1）E组不同时相Ⅳ型胶原纤维浓度均显着高于C组（P﹤0.001）,但组内呈2E最低、3E最高的规律,均与其他三组呈极显着性差异（P﹤0.001）;E组基底膜厚度在第2、3周下调且小于C组,第4周增加,组内各时相没有统计学意义。（2）I组Ⅳ型胶原纤维浓度在前三周下调,4I增加,其中1I、2I、4I组显着高于C组（P﹤0.001）,组内3I最低,与其他组呈极显着性差异（P﹤0.001）;与C组相比,I组基底膜厚度在3I（P﹤0.01）、4I（P﹤0.05）显着增加,组内3I最高与1I呈显着变化（P﹤0.001）。（3）Ⅳ型胶原纤维浓度组间比较时,2E显着小于2I（P﹤0.01）,3E显着高于3I（P﹤0.001）,4E与4I没有统计学意义;基底膜厚度组间比较时2E、3E分别小于2I（P﹤0.05）、3I（P﹤0.001）,4E与4I没有统计学意义。3.3Ⅲ型胶原纤维浓度与肌内膜厚度:（1）E组中,1E、3E和4E组Ⅲ型胶原纤维浓度显着大于C组（P﹤0.001）,2E组显着低于C组（P﹤0.05）,组内2E最低,与其他三组呈极显着性差异（P﹤0.001）,3E最高,分别与1E（P﹤0.01）、2E（P﹤0.001）呈显着变化;E组不同时相肌内膜厚度均大于C组,在第1、2、4周与C组呈极显着性差异（P﹤0.001）,3E与C组呈显着性差异（P﹤0.05）,组内比较时,3E最低,与1E（P﹤0.01）、4E（P﹤0.001）有显着差异。（2）I组中,1I和4I组Ⅲ型胶原纤维浓度显着大于C组（P﹤0.001）,组内前三周Ⅲ型胶原浓度逐周下降,3I最低,显着低于1I（P﹤0.001）、2I（P﹤0.05）、4I（P﹤0.001）;与C组相比,1I（P﹤0.01）、2I（P﹤0.01）、3I（P﹤0.001）、4I（P﹤0.05）肌内膜厚度均显着增加,但组内没有显着性差异。（3）Ⅲ型胶原纤维浓度组间比较时,2E显着低于2I（P﹤0.01）,3E极显着高于3I（P﹤0.001）,4E与4I没有统计学意义;对肌内膜厚度进行组间比较,4E极显着大于4I（P﹤0.001）。3.4Ⅰ型胶原纤维浓度与肌束膜厚度:（1）E组中,1E-4EⅠ型胶原浓度均高于C组,其中1E、3E、4E具有极显着性差异（P﹤0.001）,组内2E最低,与其他三组具有极显着性差异（P﹤0.001）;与C组相比,1E（P﹤0.01）、2E（P﹤0.05）、3E（P﹤0.001）、4E（P﹤0.001）肌束膜厚度均显着增加,组内4E最高,与1E（P﹤0.001）、2E（P﹤0.001）、3E（P﹤0.05）有显着差异。（2）I组中,1I-4I组Ⅰ型胶原纤维浓度与C组相比均增加,1I、2I与C组相比有极显着性差异（P﹤0.001）,组内没有显着性差异;I组肌束膜厚度较C组增加,1I（P﹤0.001）、2I（P﹤0.01）、4I（P﹤0.05）与C组相比有显着差异,组内没有显着性差异。（3）Ⅰ型胶原纤维浓度组间比较时,2E与2I有非常显着性差异（P﹤0.01）,3E、4E与3I、4I分别呈极显着性差异（P﹤0.001）;对肌束膜厚度进行组间比较,3E与3I具有非常显着性差异（P﹤0.01）,4E与4I具有极显着性差异（P﹤0.001）。4结论:4.1 4周连续过度离心训练引起细胞外基质结构持续重塑,用于维持细胞形态,但细胞外基质重塑不能匹配细胞形态变化,造成Ⅰ型胶原纤维浓度、肌束膜厚度过度增加,过度使用损伤症状发生。4.2 4周间歇离心训练引起细胞外基质结构持续重塑,用于维持细胞形态,细胞外基质重塑能匹配细胞形态变化,没有造成Ⅰ型胶原纤维浓度、肌束膜厚度过度增加,产生良性适应。
王世知[4]（2021）在《circ-RBM33介导细胞外基质降解在腹主动脉瘤中的作用及机制研究》文中提出研究背景及目的腹主动脉瘤（Abdominal Aortic Aneurysm,AAA）是一种血管疾病,累及腹主动脉呈瘤样扩张,超过正常直径的1.5倍。AAA主要发生在65岁以上的男性人群,是老年人群死亡的重要原因。目前,较大直径肿瘤和破裂AAA的治疗手段仍以手术治疗为主,尚未发现有效的治疗药物。AAA的发病机制较为复杂,深入探究AAA的发病机制,寻找新的诊断标记物与潜在的治疗靶点对于调控AAA疾病的发生发展具有重要意义。基因组存在一系列非编码RNA,包括circRNA、lncRNA、mi RNA等,被认为是许多生物过程和人类疾病的关键调控因子。其中,circ RNA是一种环状闭合的非编码RNA,在心血管疾病中发挥关键作用,可作为新型的标志物参与调控疾病治疗和预后。circ Fox O1、circ-IQGAP1、circ RNA010383等多种circ RNA分子已被证明在诸如糖尿病肾病、近视、骨关节炎等疾病的细胞外基质（ECM）重构中发挥作用。ECM重构是AAA的发病机制之一,其中蛋白水解酶如金属蛋白酶MMP及其抑制剂TIMP的改变是其重要的病理变化。然而,circ RNA在AAA相关的ECM重构中的作用尚不明确,具体的效应机制尚待进一步探索。本研究通过高通量测序技术解析AAA和临近动脉对照组织中的全转录组表达谱,鉴定差异表达的circ RNA、lnc RNA和m RNA。并研究关键circ RNA在AAA发展中的功能和机制,为circ RNA在AAA发展中的作用机制提供新的视角,并为AAA的预防治疗提供新思路。第一部分 人腹主动脉瘤组织全转录组测序及分析研究目的:明确人体AAA组织和对照组织中circ RNA、m RNA、和lnc RNA表达变化,揭示AAA中关键RNA的调控网络。研究方法:本研究对AAA组织和正常腹主动脉对照组织（n=3）进行全转录组测序分析,鉴定差异表达的m RNA、circ RNA和lnc RNA,并对差异表达的circ RNA和lnc RNA进行靶基因预测,通过GO与KEGG分析对差异表达circ RNA和lnc RNA进行功能和信号通路分析。研究结果:1.AAA与正常腹主动脉对照组织中存在4814个差异表达的m RNA,相比对照组织,AAA组织中有2085个m RNA表达下调,2729个m RNA表达上调。差异表达m RNA主要富集的GO条目是免疫应答、细胞粘附、ECM构成;KEGG分析显示差异表达m RNA主要参与细胞粘附分子、NF-κB信号通路、ECM-受体相互作用。2.AAA与正常腹主动脉组织中存在1231个差异表达lncRNA,相比对照组织,AAA组织中有529个lnc RNA表达下调和702个lnc RNA表达上调。GO分析显示差异lnc RNA的靶基因主要参与血管生成的正向调控、ECM构成、NF-κB转录因子活性的负调控;KEGG分析显示差异表达lnc RNA的靶基因主要参与TNF信号通路、NF-κB信号通路、NOD样受体信号通路。3.AAA与正常腹主动脉组织中存在65个差异表达circ RNA,相比对照组织,AAA组织中35个circ RNA表达下调和30个circ RNA表达上调。GO分析显示差异circ RNA的靶基因主要参与免疫系统过程、细胞粘附、ECM重构。KEGG分析显示差异表达circ RNA的靶基因主要富集在细胞粘附分子、细胞因子间的相互作用、NF-κB信号通路。第二部分 circ-RBM33调节细胞外基质降解的功能研究研究目的:明确circ-RBM33在VSMCs的ECM降解中发挥的生物学功能。研究方法:通过q RT-PCR检测5个差异最显着的circ RNA,并确定circ-RBM33为下一步的研究对象。在20对人体AAA组织与正常腹主动脉组织样本中,通过q RT-PCR验证circ-RBM33的表达,并通过sanger测序鉴定circ-RBM33的环状。在体外实验中,用Ang II处理人血管平滑肌细胞（VSMC）建立损伤模型并通过q RT-PCR检测VSMC中circ-RBM33的表达。细胞转染circ-RBM33过表达载体,通过免疫荧光和免疫印迹检测ECM重构相关蛋白MMP-2和TIMP-1的表达。研究结果:1.qRT-PCR结果显示5个候选circRNAs在AAA组织的表达趋势与测序数据相同,表明测序结果可信。其中,circ-RBM33在AAA组织中表达显着升高。因此,circ-RBM33作为研究目标用于后续实验。2.PCR扩增和sanger测序证实circ-RBM33的环状结构。3.Ang II刺激的VSMC中circ-RBM33表达上调,VSMC中过表达circ-RBM33促进MMP-2表达,并抑制TIMP-1表达,提示circ-RBM33在体外能促进ECM降解。第三部分 circ-RBM33在血管平滑肌细胞中调控机制研究研究目的:鉴定circ-RBM33吸附的mi RNA及其下游靶基因,阐明其调控ECM降解的机制。研究方法:通过生物信息学分析筛选circ-RBM33可能结合的mi RNA及靶基因。q RT-PCR检测过表达circ-RBM33后VSMC中mi R-4268表达情况。双荧光素酶报告基因实验验证circ-RBM33和mi R-4268之间的作用。q RT-PCR检测mi R-4268过表达后VSMC中SOCS3和EPHB2的表达,确定EPHB2是mi R-4268的靶基因。最后通过回复实验证实circ-RBM33通过mi R-4268调控下游靶基因EPHB2进而调控ECM降解。研究结果:1.生物信息学方法筛选出的与circ-RBM33具有互补序列的mi R-4268。VSMC中过表达circ-RBM33后显着下调mi R-4268的表达。荧光素酶报告基因实验显示mi R-4268显着激活野生型circ-RBM33的荧光活性,但对circ-RBM33突变型无显着影响。2.生物信息学结合文献报道筛选mi R-4268下游靶基因,qRT-PCR证实VSMC中过表达mi R-4268后显着下调靶基因EPHB2的表达。3.回复实验显示,mi R-4268可逆转circ-RBM33对VSMC中EPHB2的上调效应以及circ-RBM33抑制VSMCs中TIMP-1的表达效应,提示circ-RBM33可通过mi R-4268/EPHB2轴促进ECM降解。结论本研究通过全转录测序获得了AAA的circ RNA表达谱,并揭示circ-RBM33在AAA组织和Ang II刺激的血管平滑肌细胞中表达上调。circ-RBM33通过调节mi R-4268/EPHB2轴促进细胞外基质降解进而促进AAA的进展。我们的研究结果揭示了circ-RBM33促进AAA发生的具体调控机制,circ-RBM33可能是AAA患者的新生标记物和治疗靶点。
朱鹏程,张倩,卞金辉,章辉,倪布清,邵永丰[5]（2021）在《二叶式主动脉瓣钙化关键基因的生物信息学分析》文中研究说明目的采用生信分析技术探讨二叶式主动脉瓣（BAV）钙化相关的关键基因（hub基因）。方法从Gene Expression Omnibus（GEO）数据库中下载BAV相关的基因表达矩阵及临床数据,应用Perl及R软件筛选出钙化的BAV与正常主动脉瓣的差异基因（DEGs）,通过R软件对DEGs进行富集分析,使用Cytoscape构建蛋白质互作（PPI）网络。使用Degree算法计算并取排名前10的DEGs作为hub基因,分别采用miRWalk数据库及FunRich软件预测hub基因对应的microRNA并取交集,构建miRNA-mRNA调控网络。结果从数据集GSE83453中共筛选出DEGs 126个,其中上调基因85个,下调基因41个。通过PPI网络计算出10个hub基因,并由此预测出12个上游miRNA。结论 BAV瓣膜钙化通路可能与三叶式主动脉瓣瓣膜钙化相似,与其相关的hub基因是SPP和MMP。加剧BAV瓣膜病变并导致BAV相关并发症的hub基因可能是THBS2、COL5A2、COL4A1、COL1A1、COL3A1、COL4A2、COL1A2、SERPINE1。
吴俊[6]（2021）在《软骨脱细胞细胞外基质3D生物打印支架负载髌下脂肪垫间充质干细胞修复兔软骨病损的相关研究》文中研究说明研究目的软骨损伤是骨关节炎发生发展过程中极其重要的一个病理过程,临床发病率高,治疗棘手,迄今尚无满意的治疗方法。本研究期望通过组织工程学的手段,将髌下脂肪垫间充质干细胞（infrapatellar fat pad adipose derived mesenchymal stem cell,IPFP-ADSC）作为种子细胞,结合软骨脱细胞细胞外基质（decellularized cartilage extracellular matrix,dCECM）制备复合水凝胶生物墨水,利用3D生物打印的优势,实现IPFP-ADSC在支架内的均匀负载,构建具有体外成软骨分化、体内软骨缺损修复能力的活细胞生物材料,为构建组织工程化软骨修复材料并向临床转化应用提供参考。方法及结果第一部分:髌下脂肪垫间充质干细胞及软骨脱细胞细胞外基质生物学特性研究研究方法:使用Ⅰ型胶原酶消化提取新西兰大白兔IPFP-ADSC和皮下脂肪间充质干细胞（subcutaneous fat adipose derived mesenchymal stem cell,SCF-ADSC）,通过对贴壁生长和三系分化（成骨、成软骨、成脂）能力以及细胞表面标记物的检测进行干性鉴定。使用CCK-8法评估增殖能力,实时荧光定量聚合酶链式反应法（Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction,RT-PCR）检测软骨分化特异性基因Ⅱ型胶原（collagenⅡ,COL2A1）和性别决定区Y框蛋白9（Sry Related HMG Box-9,Sox-9）的表达水平对二者的成软骨分化能力进行比较。分别使用文献报道的和本课题组改良的方法,联合物理、化学和酶消化法,对猪关节透明软骨进行脱细胞处理,观察dCECM的三维微观结构,通过苏木素伊红（HE）染色比较残留的细胞数量、检测dCECM残留的胶原、糖胺聚糖（glycosaminoglycan,GAG）和双链DNA（double-stranded deoxyribonucleic acid,ds DNA）含量对两种方法的脱细胞效果进行比较。将IPFP-ADSC与dCECM共培养,CCK-8法和钙黄绿素/碘化丙啶染色法（Calcein AM/PI staining）评估细胞增殖能力和活力。分别将不同浓度的dCECM（0,5 mg/mL,10 mg/mL和20mg/mL）作用于IPFP-ADSC,进行体外成软骨诱导分化,使用免疫荧光染色法（immunofluorescent staining,IF）评估Ⅱ型胶原（collagenⅡ,COL-2）,蛋白聚糖（aggrecan,ACAN）的表达情况,RT-PCR检测COL2A1和Sox-9基因表达水平,评价dCECM促IPFP-ADSC成软骨分化的生物学作用。结果:酶消化法能成功提取IPFP-ADSC和SCF-ADSC,二者均符合国际干细胞治疗学会（International Society for Stem Cell Therapy）提出的干细胞标准,具备贴壁生长,成骨、成软骨、成脂三系分化潜能,高表达CD73、CD90和CD105（>99%）,低表达CD34、CD45和HLA-DR（<1%）。相比SCF-ADSC而言,IPFP-ADSC体外增殖能力、成软骨分化能力更强,COL2A1和Sox-9基因表达水平更高（P<0.05）。两种脱细胞方法均能充分地去除软骨细胞,HE染色未见明显细胞核残留,残留ds DNA<5%。改良的脱细胞方法增加了对细胞物理破壁的次数,减少了胰酶的使用,dCECM胶原成分得以更多保留（74%vs 59.5%,P<0.05）。dCECM与IPFP-ADSC共培养,细胞生长状态良好、无脱壁现象,共培养7天时细胞活力大于90%（P>0.05）。体外诱导下,dCECM表现出促进IPFP-ADSC成软骨分化的作用,COL-2、ACAN蛋白表达量和COL2A1、Sox-9基因表达水平随着浓度的增加而提高（P<0.05）。第二部分:负载IPFP-ADSC的dCECM水凝胶支架的3D构建及其生物学特性研究第一节dCECM复合水凝胶生物墨水制备及3D打印水凝胶支架物理特性研究研究方法:制备甲基丙烯酸酐明胶/海藻酸盐（GelMA/ALG）复合水凝胶,按不同浓度添加dCECM（A:3%、B:5%、C:7%,w/v,g/mL）制备3种dCECM/GelMA/ALG复合水凝胶生物墨水,使用旋转流变仪测定黏度、弹性模量,使用Calcein AM/PI染色评估不同时间点复合水凝胶生物墨水中IPFP-ADSC细胞的活力。利用捷诺飞Regenovo3D Bio-Architect?3D生物打印系统进行打印,探索打印条件,构建水凝胶生物支架,并进一步评估水凝胶支架的机械性能、孔隙率、溶胀率、体外降解速度等物理特性。结果:三种dCECM/GelMA/ALG复合水凝胶墨水均呈现出凝胶样外观和可逆的凝胶-溶胶转变温敏特性。随着剪切速率增加黏度逐渐下降,呈现典型的“剪切变稀”现象和。三种水凝胶均有清晰的成胶点温度:A、B墨水在32～33℃,C墨水在27～29℃。72 h时,三组（非固化）生物墨水内细胞活力均>80%,C组细胞活力最差（P<0.05）,A、B组间无显着差别。通过调整打印参数,三种生物墨水均能成功实施3D生物打印。A组（dCECM浓度3%）支架机械性能、孔隙率、溶胀率较高,但体外降解速度最快,C组（dCECM浓度7%）机械性能、孔隙率、溶胀率较差,但体外降解速度最慢。第二节3D生物打印负载IPFP-ADSC组织工程支架体外成软骨分化生物学特性研究研究方法:基于第一节的结果,本节生物墨水中添加5%的dCECM进一步负载IPFP-ADSC构建活细胞3D生物打印支架,实验分为两组:IPFP-ADSC/dCECM（+）/GelMA/ALG组和IPFP-ADSC/dCECM（-）/GelMA/ALG组,IPFP-ADSC细胞密度为107/mL。利用捷诺飞Regenovo 3D Bio-Architect?系统分别构建两种活细胞支架并进行体外成软骨诱导分化。使用Calcein AM/PI染色法评估支架内的细胞活力（第3/7/14/28天）。免疫荧光染色法观察支架内COL-2和Sox-9的生成情况（第7/14/28天）。酶联免疫吸附法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA）测定培养液中游离COL-2、ACAN的表达水平（3/7/10/14/21/28天）。应用蛋白免疫印迹法（Western Blot）和RT-PCR法测定不同时间（第14/28天）、不同培养条件（2D和3D）下两组支架内IPFP-ADSC成软骨分化特异性蛋白（COL-2、Sox-9）和基因（COL2A1、Sox-9）的表达情况,评价dCECM和3D立体培养对IPFP-ADSC成软骨分化的影响。结果:打印后第2周,IPFP-ADSC活力均大于90%,第4周细胞活力均大于85%,各时间点差异无统计学意义（P>0.05）。COL-2和Sox-9荧光染色荧光强度随着时间推移逐渐增强,第4周时dCECM（+）组明显高于dCECM（-）组（P<0.05）。ELISA显示dCECM（-）组在第3周时培养液上清COL-2和ACAN含量与dCECM（+）组第2周水平相当;第4周时,dCECM（+）组明显高于dCECM（-）组（P<0.05）。Western Blot和RT-PCR结果显示,COL-2、Sox-9等软骨相关蛋白及基因表达水平随着诱导时间延长逐步提高:第4周时,无论是dCECM（+）组还是dCECM（-）组,3D培养条件下COL-2、Sox-9表达量均高于2D培养;无论2D还是3D培养,dCECM（+）组COL-2、Sox-9表达量均高于dCECM（-）组（P<0.05）。第三部分:3D生物打印负载IPFP-ADSC组织工程支架修复兔软骨缺损的实验研究研究方法:IPFP-ADSC及3D生物打印负载IPFP-ADSC的组织工程支架的免疫原性评估:选择新西兰大白兔作为实验动物,实验分为四组——PBS、IPFP-ADSC、dCECM/GelMA/ALG支架和IPFP-ADSC/dCECM/GelMA/ALG支架组,分别进行皮下注射或者皮下支架包埋,第2、4周时取材进行大体观察及HE染色以评价细胞和支架的免疫原性。新西兰大白兔股骨滑车软骨缺损的模型建立及修复:实验分为4组,PBS关节腔注射（A组）、IPFP-ADSC关节腔注射（B组）、dCECM/GelMA/ALG支架植入联合IPFP-ADSC关节腔注射（C组）和IPFP-ADSC/dCECM/GelMA/ALG支架植入组（D组）。新西兰大白兔股骨滑车沟制作直径4 mm,深约3 mm的全层软骨缺损,按上述分组分别对软骨缺损进行修复。第6、12周时取材,对修复效果进行大体观察评分（International Cartilage Repair Society Score）和组织学染色评分（The Modified O’Driscoll Histological Score）,评价3D生物打印负载IPFP-ADSC的组织工程支架对兔股骨滑车软骨缺损的修复效果。结果:第2/4周时,PBS及IPFP-ADSC皮下局部注射区未见异常新生组织块及粘连现象。dCECM/GelMA/ALG和IPFP-ADSC/dCECM/GelMA/ALG支架皮下包埋第二周时存在一定程度的异物炎症反应,局部包膜组织充血、粘连,可见较多炎症细胞浸润,高倍镜下中性粒细胞浸润数量比较无组间差异（3.6±0.5 vs 3.4±0.5,P>0.05）;第4周时,细胞浸润现象明显减轻,支架与周围组织无粘连充血,包膜变薄,高倍镜观察细胞浸润数量同样无组间差异（1.4±1.14 vs 1.8±0.8,P>0.05）,随时间推移,炎症反应逐渐减轻（P<0.05）。兔软骨缺损造模成功,缺损修复大体外观及组织学染色评分结果显示:软骨组织几乎没有自我修复能力;IPFP-ADSC/dCECM/GelMA/ALG支架修复效果最好,缺损部位基本完全被新生的软骨组织所覆盖,关节面光滑度高、与周围组织结合紧密,胶原、蛋白多糖沉积更多;dCECM/GelMA/ALG支架联合IPFP-ADSC关节腔注射修复效果次之,新生组织与正常软骨结合略差,关节面欠光滑,胶原、蛋白多糖沉积不均匀;单纯关节腔注射IPFP-ADSC软骨缺损处有一定程度的新生软骨,但组织松脆、结构杂乱,胶原沉积较少。大体观察与组织学染色评分组间差异有统计学意义（P<0.05）。结论胶原酶消化法能够成功获取IPFP-ADSC,具备多向分化潜能,相较于SCF-ADSC,具有更强的体外增殖和成软骨分化能力,获取方便,可作为理想的软骨修复组织工程学种子细胞。改良的软骨脱细胞方法,通过加强物理破壁过程、减少胰酶的使用,同样可以充分地去除软骨细胞,三维微观结构得以保留,更多保留胶原成分。dCECM生物相容性较好,具有促进IPFP-ADSC体外增殖和成软骨分化的生物活性作用。dCECM/GelMA/ALG复合水凝胶生物墨水具备良好的生物相容性和可打印性,利用3D生物打印的优势,可以构建空间有序、均匀负载IPFP-ADSC的仿生支架,在dCECM和3D立体培养协同作用下,能更快更好地向软骨细胞分化。异体IPFP-ADSC和含异种dCECM的IPFP-ADSC/dCECM/GelMA/ALG支架免疫原性低,组织相容性好。相对于单纯的IPFP-ADSC关节腔内注射或dCECM/GelMA/ALG支架联合IPFP-ADSC关节腔注射这种细胞支架无序结合的修复材料,IPFP-ADSC/dCECM/GelMA/ALG 3D生物打印支架对大白兔软骨缺损具有更快更优的修复效果。利用3D生物打印技术的优势,联合IPFP-ADSC和dCECM构建的活细胞组织工程支架实现了将种子细胞、生物活性因子和支架材料均一、有序有机整合的目的,具有良好的体外成软骨分化能力和体内软骨缺损修复效果,是一种极具临床转化应用价值的软骨修复组织工程学治疗手段。
孙烁[7]（2021）在《多孔聚醚醚酮微球的制备、表面改性及在骨修复中的应用》文中进行了进一步梳理研究目的:制备基于聚醚醚酮材料的多孔微球并进行表面改性处理,探究其在骨修复中的应用。材料与方法:1、前期工作中,利用液-液相置换法已制备出表面光滑的PEEK微球。本研究对光滑PEEK微球进行羟化处理,制备出多孔PEEK微球,对其进行电镜观察、傅里叶红外分析、压汞仪、水接触角、蛋白吸附能力和浸提液细胞毒性测试。进一步利用矿化培养和反复脱细胞技术,将矿化细胞外基质包被于多孔PEEK微球表面。使用电镜对矿化细胞外基质进行形貌观察,利用能量散射X线光谱仪和热重分析仪分别对其进行定性和定量检测。2、对多孔PEEK微球和表面包被矿化细胞外基质的多孔PEEK微球进行体外生物形容性和体内成骨性能瓶评估。通过钙黄绿素染色和电镜观察不同微球表面MC3T3-E1细胞黏附和细胞外基质分泌情况,DAPI染色和CCK法评估微球对于细胞增殖的影响。利用碱性磷酸酶染色和活性检测、茜素红染色和钙定量检测、Runx2和Col-1两种成骨相关基因表达情况评估微球体外成骨活性。构建大鼠颅骨缺损模型,通过Mirco-CT重建分析和组织切片苏木精-伊红和马松染色进一步评估微球的体内成骨效果。3、利用多巴胺（dopamine,DA）涂层的黏附特性,将胰岛素样生长因子1（insulin-like growth factor 1,IGF-1）和骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein 2,BMP-2）同时固定于多孔PEEK微球。对于黏附DA涂层后的微球进行颜色和表面形貌观察,利用X线光电子能谱分析表面元素组成和比例,接触角评估亲水性。酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）对微球表面黏附的生长因子量和14天内的释放行为进行分析。利用碱性磷酸酶染色和活性检测、茜素红染色和钙定量检测、Runx2、OPN和OCN三种成骨相关基因表达情况评估微球体外成骨活性。构建大鼠颅骨缺损模型,通过Mirco-CT重建分析和组织切片苏木精-伊红和马松染色进一步评估微球的体内成骨效果。结果:1、电镜观察表明,经过羟化处理后,多孔PEEK微球球形度保持良好,表面孔隙结构分布均匀。傅里叶红外分析显示,多孔微球表面羰基峰强度降低且出现新的羟基峰。压汞仪检测显示,多孔微球的孔隙率大于90%,平均孔径为569.72nm。同光滑微球相比,多孔微球的水接触角显着降低,蛋白吸附能力有所提升。经矿化培养和反复脱细胞处理后,微球表面经元素分析发现有氮、钙和磷元素的出现。通过电镜观察发现,随着脱细胞次数的增加,多孔微球表面包被的矿化细胞外基质更致密且分布更加均匀。热重分析仪的结果显示,随着脱细胞次数的增加,微球在400℃下的质量损失可从6.41%升至12.38%。多孔PEEK微球的浸提原液和稀释一倍后,其细胞存活率分别大于85%和95%。2、微球与MC3T3-E1细胞共培养后,在各观察时间点,钙黄绿素、DAPI染色、CCK检测和电镜观察显示,同光滑微球相比,多孔微球表面的细胞数目更多,细胞多呈扁平球状且伪足更多,细胞黏附状态更佳且细胞外基质的分泌更旺盛。随着脱细胞次数的增加,微球表面黏附的细胞量和CCK法检测细胞增殖的吸光度值不断提高。经碱性磷酸酶染色和茜素红染色,多孔微球表面的着色较光滑微球明显加深,碱性磷酸酶的活性、钙定量分析、Runx2和Col-1的表达水平也显着提高。多孔微球表面在包被矿化细胞外基质后,其上述体外成骨能力检测指标均进有明显提升。Micro-CT重建显示,包被矿化细胞外基质的微球组,4周时颅骨缺损区域已基本被覆盖,8周时其骨密度明显高于其它两组,骨组织分数分别为42.19±2.80%和65.19±1.63%,同样显着高于其它两组。组织切片染色发现,光滑微球周围以纤维组织包裹为主,且不能与周围新生组织形成强有力的键合,导致切片中出现较多的微球缺失。多孔微球周围则以新生骨组织为主,与周围新生组织键合紧密,没有出现微球缺失的情况。表面包被矿化细胞外基质的微球周围以成熟骨组织为主,结构致密且周围有较多新生血管。3、多孔微球表面黏附DA涂层后,颜色由之前的白色变为均一的灰黑色,电镜观察则无明显变化。元素分析表明黏附DA涂层后,微球表面出现氮元素,定量分析表明,DA涂层黏附IGF-1后,氮元素占比由1.58%升至1.71%。DA涂层可以将多孔微球的水接触角由65.88±4.55°降至51.08±3.7°。ELISA检测证实,DA涂层可将生长因子固定于多孔PEEK微球且在14天内具有较为缓慢的释放曲线。微球与MC3T3-E1细胞共培养后,在各观察时间点,钙黄绿素、DAPI染色、CCK检测显示,含有IGF-1的微球组细胞黏附状态更佳且细胞数目更多,CCK检测表明,双生长因子组的增值率略低于IGF-1组,差异无显着性,但显着高于其它各组。经碱性磷酸酶染色和茜素红染色,含BMP-2的微球组着色明显加深,但单一BMP-2组与双生长因子差异不明显。含有双生长因子微球的碱性磷酸酶活性、钙定量分析、14天时Runx2、OPN和OCN的表达水平也显着高于其它各组。MicroCT重建显示,双生长因子组在8周时不仅能将缺损区域完全覆盖,且其骨密度较高,骨缺损区域的中央几乎与缺损边缘等高。冠状位CT影像上可观察到在可透射线PEEK微球的上方有骨性连接,形成“骨桥”结构,将骨缺损边缘和中央区的新生骨进行连接。双生长因子组在8周时的骨组织分数为85.79±6.20%,显着高于其它各组。组织切片染色观察可见,双生长因子组骨组织结构致密且以成熟骨组织为主,血管更为密集。结论:1、光滑PEEK微球经过羟化处理后可制备出表面孔隙结构均一的多孔PEEK微球。2、通过改变接收液的温度和成分比例可以调控微球表面的孔径大小。3、利用矿化培养和脱细胞技术,可以在多孔PEEK微球表面成功包被矿化细胞外基质,且随着脱细胞次数的增加其质量分数更高、分布更均匀。4、多孔微球同光滑微球比更有利于细胞的黏附、增殖,促进了细胞外基质的分泌。5、多孔PEEK微球在表面包被矿化细胞外基质后,进一步促进了细胞的黏附和增殖,提高了碱性磷酸酶的活性、钙质沉积能力和成骨相关基因表达水平,大鼠颅骨缺损的修复效果更优异。6、DA涂层可将IGF-1和BMP-2两种生长因子固定于多孔PEEK微球,在14天内均有较为缓慢的释放行为。7、负载双生长因子的微球同单一种类生长因子相比,其体外成骨诱导能力和大鼠颅骨缺损修复效果均有所提高。本研究的创新之处:1、通过羟化处理,一步法实现微球表面化学和物理双改性。2、利用矿化培养和反复脱细胞技术在微球表面成功包被矿化细胞外基质。3、IGF-1和BMP-2联用促进骨修复效果,可降低单一生长因子使用剂量。
徐燕梅[8]（2021）在《兔胫骨骨膜细胞膜片体外构建研究》文中进行了进一步梳理颌面部骨组织因其结构的复杂性,其缺损的修复再生一直是当前临床研究的难点与热点。组织工程技术的出现为实现理想的颌面部骨缺损修复带来了希望。细胞膜片技术（cell sheet technology,CST）可完整保留细胞外基质（extracellular matrix,ECM）,克服骨组织工程支架材料的缺点,在骨缺损修复中具有很大的应用前景。目的体外分离培养兔胫骨骨膜细胞（periosteal cells,PCs）,构建兔胫骨PCs膜片,对膜片形成过程中PCs的生物学特点进行研究。方法1.采用酶消化结合组织块法分离培养兔胫骨PCs,CCK-8（cell counting kit-8）检测兔胫骨PCs增殖能力。集落形成试验检测兔胫骨PCs克隆形成能力。采用碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）及茜素红染色检测兔胫骨PCs的成骨分化能力。油红O染色检测兔胫骨PCs的成脂分化能力。阿利辛蓝染色检测兔胫骨PCs成软骨诱导后的成软骨分化能力。2.采用维生素C诱导法构建兔胫骨PCs膜片,通过HE及Masson染色对细胞膜片的组织形态进行观察;通过细胞活死荧光染色检测细胞膜片的活性。3.通过ALP染色、ALP活性检测以及实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,Real-time PCR）检测膜片形成过程中兔胫骨PCs的成骨分化能力和ECM形成能力。4.采用CCK-8、β-半乳糖苷酶染色、流式细胞术以及Real-time PCR对膜片形成过程中兔胫骨PCs的增殖活性、衰老及凋亡情况进行检测。结果1.体外成功分离培养兔胫骨PCs。所培养的细胞具有较好的增殖能力、克隆形成能力;成骨诱导培养7 d及21 d,ALP染色呈深蓝色,茜素红染色显示大小不一、红色的钙结节;成脂诱导21 d,脂滴油红O染色呈阳性;成软骨诱导21 d,阿尔辛蓝染色阳性。2.采用维生素C可成功构建兔胫骨PCs膜片,所构建的膜片呈乳白色半透明膜片样物质,HE及Masson染色显示膜片由细胞及丰富的细胞外基质构成,存在良好的细胞间连接;细胞活死荧光染色结果显示膜片内兔胫骨PCs保持较好的活性。3.ALP染色及ALP活性检测结果显示膜片构建过程中兔胫骨PCs表达较高的ALP活性;Real-time PCR结果显示成骨相关基因骨桥蛋白（osteopontin,OPN）、ALP及Runt转录相关因子2（runt-related transcription factor 2,Runx2）,ECM相关基因Ⅰ型胶原（collagen typeⅠ,COL-Ⅰ）及纤维连接蛋白（fibronectin,FN）的表达也增加。4.CCK-8结果显示膜片构建过程中兔胫骨PCs具有较好的增殖活性;β-半乳糖苷酶染色显示膜片构建过程中兔胫骨PCs中β-半乳糖苷酶染色阳性细胞数相对较少;流式细胞术检测结果显示膜片构建过程中兔胫骨PCs的凋亡率较低;Real-time PCR结果显示膜片构建过程中兔胫骨PCs中p21、p53、半胱氨酸蛋白酶3（cysteinyl aspartate specific proteinase 3,Caspase 3）、Bax等衰老、凋亡相关基因表达较低,而抗凋亡基因Bcl2表达较高。结论1.采用酶消化结合组织块法可体外分离培养兔胫骨PCs,所培养的细胞具有较好的增殖能力和克隆形成能力,并具有多向分化潜能。2.采用维生素C能成功诱导构建兔胫骨PCs膜片,所构建的细胞膜片由大量活细胞及丰富的细胞外基质构成,有望应用于颌面部骨组织的再生。
钟华建[9]（2021）在《碳水化合物磺基转移酶3在椎间盘退变中的作用及调控机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景与目的颈腰痛是临床常见症状,严重影响患者日常工作状态,部分患者甚至因颈腰痛丧失生活自理能力。全球有8亿颈腰痛患者,高昂的治疗费用给多个国家的医疗系统带来沉重负担,甚至引发社会矛盾,因此,颈腰痛是亟待解决的健康问题。多项研究表明椎间盘退变和颈腰痛密切相关,椎间盘是相邻椎体之间的结缔组织,内含充足水分,对维持脊柱稳定性及活动度至关重要。椎间盘发生退变时,组织内水分大量丢失,导致椎间盘失去弹性,易在急性应力作用下发生突出、塌陷等,引发临床症状。硫酸软骨素是椎间盘内最为重要的保水成分,而其保水功能的发挥依赖于硫酸化反应引入携带负电荷的硫酸基团,因此,硫酸软骨素硫酸化对于维持椎间盘内水分以及椎间盘正常结构和功能至关重要。碳水化合物磺基转移酶3（CHST3）是催化硫酸软骨素硫酸化的关键酶,大样本、多中心临床研究表明CHST3基因上的单核苷酸突变与椎间盘退变密切相关,而内在调控机制尚不明确。本课题拟研究CHST3与椎间盘退变的相互作用及调控机制。第一部分:椎间盘退变时CHST3表达差异及调控机制研究方法:（1）从临床收集不同退变等级的人椎间盘组织,采用Real-time RT-PCR及Western Blot检测CHST3在各级组织中的表达变化;（2）收集小鼠退变与非退变椎间盘组织,通过免疫组化检测CHST3表达水平,进一步明确椎间盘退变对CHST3的表达影响;（3）采用外源性促炎因子IL-1β及TNFα模拟椎间盘退变时的炎症反应,诱导髓核细胞退变,检测炎症反应对髓核细胞内CHST3表达水平的影响,并采用Luciferase实验探究炎症反应对CHST3的表达调控机制;结果:CHST3在人及小鼠退变椎间盘组织中表达显着下降,促炎因子刺激髓核细胞后,CHST3 m RNA及蛋白水平均显着减少,Luciferase结果显示促炎因子抑制CHST3启动子活性;炎症反应相关通路NF-ΚB及JAK/STAT通路在促炎因子刺激的髓核细胞内显着激活,其下游转录因子NF-ΚB1及STAT3可结合到CHST3启动子序列,抑制启动子活性,说明NF-ΚB及JAK/STAT通路可通过靶向调控抑制炎性环境下CHST3的表达。结论:椎间盘退变时,炎症反应通过NF-ΚB及JAK/STAT通路靶向抑制CHST3表达。第二部分:CHST3影响椎间盘退变的作用研究方法:（1）CHST3干扰质粒si CHST3及过表达质粒oe CHST3分别转染正常及促炎因子诱导退变的髓核细胞,通过流式细胞术检测髓核细胞凋亡比例,通过Western Blot检测凋亡相关蛋白（Cleaved Caspase 3及BAX）表达水平,通过Real-time RT-PCR检测细胞外基质代谢相关基因（包括降解相关基因MMP-1,-3,-9,ADAMTS-4,-5及合成相关基因Aggrecan,COL2A1）表达水平,从而明确CHST3对正常及退变髓核细胞的作用。（2）采用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建CHST3基因敲除(CHST3-/-)小鼠并进行鉴定;（3）收集CHST3-/-小鼠身长及体重数据分析发育情况,并通过核磁共振（MRI）及组织病理染色检测小鼠椎间盘退变情况,通过免疫组化检测椎间盘内细胞外基质代谢相关基因（Aggrecan、MMP-3和ADAMTS-4）表达情况;（4）采用针刺法构建大鼠椎间盘退变模型,往退变大鼠椎间盘内注射CHST3过表达腺相关病毒进一步明确CHST3对椎间盘退变的作用。结果:CHST3表达抑制后,正常髓核细胞凋亡显着增多,细胞外基质降解相关基因表达增加,合成相关基因减少,CHST3过表达在退变髓核细胞中呈现相反结果,说明CHST3对维持正常髓核细胞活性及功能,缓解退变髓核细胞表型具有重要作用;为进一步探究CHST3对椎间盘退变的影响,根据CHST3基因结构设计并合成sg RNA,通过显微注射方法将Cas9 m RNA及CHST3 sg RNA转入野生型小鼠受精卵中,体外培养至2细胞胚胎后移植到ICR品系假孕母鼠体内,获得F0代小鼠并进一步扩大繁殖获得F2代Wild-type（WT）、CHST3+/-以及CHST3-/-小鼠,组织蛋白Western Blot结果显示CHST3-/-小鼠体内CHST3敲除效果可靠,脱靶位点分析结果显示CHST3 sg RNA前20个潜在脱靶位点均未出现脱靶事件;生长发育结果显示CHST3-/-小鼠出生后4周即表现出身长显着短于WT和CHST3+/-小鼠,影像学及组织病理学发现4周龄CHST3-/-小鼠出现椎间盘退变表型,免疫组化结果显示CHST3-/-小鼠椎间盘组织中细胞外基质合成相关基因Aggrecan表达减少,而降解相关基因MMP-3,ADAMTS-4表达增多,说明CHST3敲除可诱发小鼠椎间盘退变;大鼠退变椎间盘内注射CHST3过表达腺相关病毒后,核磁共振及组织病理染色呈现的退变征象显着缓解,组织内细胞外基质降解相关基因表达显着减少,合成相关基因显着增加,说明CHST3过表达可显着缓解甚至逆转椎间盘退变进程。结论:CHST3是维持正常椎间盘结构和功能,延缓椎间盘退变进程的保护性基因,具有作为椎间盘退变生物治疗靶点的潜在意义第三部分:CHST3通过自噬调控椎间盘退变的机制研究方法:（1）通过免疫组化检测CHST3-/-及WT小鼠椎间盘组织中自噬标志性基因LC3及ATG7的表达差异,初步明确CHST3对自噬的调控作用;（2）采用不同硫酸化模式的硫酸软骨素（包括CS-A、CS-C、CS）刺激髓核细胞,通过透射电镜检测细胞内自噬活性,通过免疫荧光及Western Blot检测细胞内LC3及ATG7表达变化;（3）采用自噬抑制剂氯喹处理CHST3过表达的退变髓核细胞,通过流式细胞术检测细胞凋亡,通过Real-time RT-PCR检测细胞外基质代谢相关基因表达变化。结果:CHST3-/-小鼠椎间盘组织中LC3表达水平显着低于WT小鼠,说明CHST3对自噬具有正向调控作用;细胞实验结果表明,CS-C（CHST3催化完成硫酸化的硫酸软骨素）显着促进髓核细胞内自噬体及自噬溶酶体的合成,并上调LC3及ATG7表达水平,而CS-A（CHST11、12、13催化完成硫酸化的硫酸软骨素）不具备该作用,说明不同硫酸化模式的硫酸软骨素对髓核细胞自噬影响各异,而CHST3可能通过催化硫酸软骨素硫酸化调控自噬;此外,髓核细胞自噬被抑制后,CHST3过表达对退变髓核细胞的保护作用被显着削弱,表现为细胞凋亡增加,细胞外基质降解相关基因表达增加,合成相关基因表达减少,说明自噬是CHST3延缓髓核细胞退变乃至椎间盘退变的重要中间环节。结论:CHST3可能通过调控硫酸软骨素硫酸化影响髓核细胞内自噬活性,从而发挥保护椎间盘,延缓退变进程的重要作用。小结本研究基于人体及小鼠椎间盘组织发现CHST3在椎间盘退变时表达显着减少,并通过细胞及分子实验阐明退变椎间盘内,CHST3受炎症反应及其下游NF-ΚB、JAK/STAT通路调控表达的上游机制;此外,基于细胞实验发现CHST3对髓核细胞活性及功能的维持具有重要作用,并利用CHST3-/-小鼠及针刺诱导退变的大鼠椎间盘退变模型进一步证实CHST3对椎间盘具有保护作用,并可延缓甚至逆转退变进程;最后,基于细胞实验及CHST3-/-小鼠组织发现CHST3可能通过调控硫酸软骨素硫酸化影响髓核细胞自噬,从而缓解椎间盘退变的下游机制。通过本研究,初步阐明CHST3与椎间盘退变的相互作用及内在调控机制。
孙琪[10]（2021）在《狄诺塞麦对卵巢切除合并腰椎融合大鼠邻近节段椎间盘退变的作用及其机制》文中研究表明第一部分大鼠卵巢切除合并腰椎融合诱发邻近节段椎间盘退变模型的研究目的:本研究拟对卵巢切除（Ovariectomy,OVX）大鼠进行腰椎融合手术（Posterolateral lumbar fusion,PLF）,建立邻近椎间盘退变（Adjacent segmental intervertebral disc degeneration,ASDD）的动物模型。观察腰椎融合后相邻椎体和椎间盘的退变情况,进一步讨论腰椎融合术后ASDD病理情况以及去除卵巢引起雌激素减少对ASDD的影响。方法:将雌性3月龄Sprague-Dawley（SD）大鼠40只随机分为以下4组:Sham组（假手术组）、OVX组（双侧卵巢切除组）、PLF组（腰椎融合组）以及OVX+PLF组（卵巢切除合并腰椎融合组）。大鼠3月龄时进行OVX术,术后4周再行PLF术。PLF术是对L4-5节段双侧融合同时将自体髂骨研磨呈颗粒状进行自体骨移植并使用钢丝穿过棘突缠绕,使之得以固定。在PLF术4周后,对行PLF术的动物进行X-ray扫描检查,观察腰椎融合情况并进行影像学评分,随之安乐死动物并取材,保留L3-6节段及其椎间盘。采用手法评估去检测腰椎融合情况,对标本进行微计算机断层扫描技术（Micro-computed tomography,Micro-CT）检测,分离提取L5-6椎间盘及相邻椎体,进行脱钙、包埋、切片,并采用HE染色评估ASDD情况。结果:1融合评估1.1X线检测结果:与OVX+PLF组相比,PLF组L4-5节段新骨形成和影像学密度增加。同时影像学评分结果证实PLF组显着高于OVX+PLF组（P<0.05）。由于Sham与OVX组未行PLF术,故未参与融合评分。1.2手法检测结果:作为检测融合情况的金标准,对PLF和OVX+PLF组行手法检查,发现L4-5节段固定良好,并且缠绕棘突的钢丝完整,未检测到融合节段的活动情况。2 Micro-CT检测结果与Sham组相比,OVX组和OVX+PLF组合大鼠的BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th均显着降低（P<0.01）,而Tb.Sp显着增加（P<0.05,P<0.01）。然而Sham组与PLF组之间没有显着差异（P>0.05）。DHI评分在Sham组中显着高于OVX组,PLF组和OVX+PLF组（P<0.01）,OVX+PLF组的DHI评分显着低于OVX组和PLF组（P<0.05,P<0.01）,DHI评分在OVX组和PLF组之间未见显着差异（P>0.05）。3组织学检测及评分结果HE染色显示:与Sham组相比,OVX组、PLF组和OVX+PLF组髓核细胞减少且部分发生黏液样退变,纤维环排列紊乱,终板钙化增加,这种变化在OVX+PLF组中表现的尤为明显。组织学评分结果显示:与Sham组相比,OVX组、PLF组和OVX+PLF组评分显着增高（P<0.05）,与OVX组和PLF组相比,OVX+PLF组评分显着增高（P<0.05,P<0.05）,然而OVX组与OVX+PLF组之间无显着差异（P>0.05）。第二部分狄诺塞麦对卵巢切除大鼠合并腰椎融合诱发邻近节段椎间盘退变的作用目的:本研究拟对卵巢切除合并腰椎融合术诱导邻近节段椎间盘退变模型给予狄诺塞麦（Denosumab,Dmab）进行干预,从而观察Dmab对ASDD的作用。方法:将雌性3月龄Sprague-Dawley（SD）大鼠60只随机分为以下5组:Sham组、OVX组、PLF组以及OVX+PLF组和OVX+PLF+Dmab组,对大鼠分别行假手术（Sham组）,双侧卵巢切除（OVX组）,腰椎融合（PLF组）,卵巢切除合并腰椎融合（OVX+PLF组）和卵巢切除合并腰椎融合Dmab干预（OVX+PLF+Dmab组）。腰椎融合术72小时后,OVX+PLF+Dmab组大鼠经皮下注射给予Dmab治疗干预,剂量为0.25mg/kg/day,一周五天,其余各组大鼠经皮下注射给予等体积的生理盐水。在Dmab干预4周后对大鼠行安乐死并取材,保留L3-6节段及其椎间盘,同时采用手法评估去检测腰椎融合情况,随之行Micro-CT检测,提取L3-4椎间盘的m RNA行RT-PCR检测基质金属蛋白酶-13（Matrix metalloproteinase-3,MMP-13）、聚集蛋白聚糖（Aggrecan,Agg）和血小板型金属蛋白酶4（A sidintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 4,ADAMTS-4）m RNA的表达水平,将L5-6椎间盘及相邻椎体分离提取,并进行脱钙、包埋、切片。对L5-6椎间盘分别进行免疫组织化学染色检测MMP-13、Agg和ADAMTS-4的蛋白表达水平。结果:1手法检测:对PLF组、OVX+PLF组和OVX+PLF+Dmab组行手法检查,发现L4-5节段固定良好并且缠绕棘突的钢丝牢固完整,未检测到融合节段的活动情况。2 Micro-CT检测结果与Sham组相比,OVX组和OVX+PLF组合大鼠的BMD、BV/TV、和Tb.N均显着降低（P<0.01）,而Tb.Sp均显着增加（P<0.05,P<0.01）。与OVX+PLF组相比,OVX+PLF+Dmab组BMD、BV/TV和Tb.N均显着增加（P<0.01）,而Tb.Sp显着降低（P<0.01）。然而Sham组与PLF组之间没有显着差异（P>0.05）。3免疫组织化学染色与Sham组相比,OVX组、PLF组与OVX+PLF组中MMP-13（P<0.01）和ADAMTS-4（P<0.05,P<0.05,P<0.01）蛋白表达水平均增高而Agg（P<0.01）蛋白表达均降低。与OVX+PLF组相比,OVX+PLF+Dmab组中MMP-13（P<0.01）和ADAMTS-4（P<0.01）蛋白表达水平均显着降低而Agg（P<0.01）蛋白表达均显着增高。4 RT-PCR检测与Sham组相比,OVX组、PLF组与OVX+PLF组中MMP-13（P<0.01）和ADAMTS-4 m RNA（P<0.01）表达水平显着增高而Agg m RNA表达显着降低（P<0.01）。与OVX+PLF组相比,OVX+PLF+Dmab组中MMP-13（P<0.01）和ADAMTS-4 m RNA（P<0.01）表达水平显着降低而Agg（P<0.01）蛋白表达显着增高。第三部分狄诺塞麦对卵巢切除合并腰椎融合诱发相邻节段椎间盘退变作用机制的研究目的:本研究基于Dmab可以延缓卵巢切除大鼠合并腰椎融合后邻近节段椎间盘退变,然而其作用机制尚未研究,拟应用卵巢切除合并腰椎融合诱导邻近节段椎间盘退变模型,早期经皮下注射给予Dmab干预,进一步探讨Dmab对卵巢切除合并腰椎融合后大鼠邻近节段椎间盘退变的作用机制。方法:将雌性3月龄Sprague-Dawley（SD）大鼠60只随机分为以下5组:Sham组、OVX组、PLF组以及OVX+PLF组和OVX+PLF+Dmab组,对大鼠分别行假手术（Sham组）,双侧卵巢切除（OVX组）,腰椎融合（PLF组）,卵巢切除合并腰椎融合（OVX+PLF组）和卵巢切除合并腰椎融合Dmab干预（OVX+PLF+Dmab组）。腰椎融合术72小时后,OVX+PLF+Dmab组大鼠经皮下注射给予Dmab治疗干预,剂量为0.25mg/kg/day,一周五天,其余各组大鼠经皮下注射给予等体积的生理盐水。在Dmab干预4周后,安乐死动物并取材,保留L3-6节段及其椎间盘,Micro-CT分析L6椎体终板结构的变化,同时采用手法评估去检测腰椎融合情况。置于10%福尔马林溶液中固定保存,然后对标本进行脱钙、包埋、切片。对L5-6椎间盘进行免疫组织化学染色检测SOX-9（Sry related HMG box-9,SOX-9）和CD24（Cluster of differentiation 24,CD24）,番红O固绿染色染色评估ASDD情况。对L6椎体进行压缩试验检测椎体生物力学参数的变化。结果:1融合评估手法检测结果:对行腰椎融合的所有动物（PLF组、OVX+PLF组和OVX+PLF+Dmab组）进行手法检查,结果证实大鼠L4-5节段固定良好并且缠绕棘突的钢丝完整。均未检测到融合节段存在活动情况。2 L5-6终板检测在Sham组中可以观察到完整的终板结构,骨质结构相对紧密,在OVX组、PLF组和OVX+PLF组中发现终板存在不同程度骨质丢失的情况,同时发现终板上存不同程度的空隙,然而在OVX+PLF+Dmab中上述情况得以显着改善。分析结果证实,与Sham组相比,OVX组和OVX+PLF组中大鼠终板的Po.N均降低（P<0.05,P<0.01）,而Po（op）（P<0.05,P<0.01）和Po.V（tot）（P<0.01）显着增高。然而再给予Dmab治疗后,与OVX+PLF组相比,OVX+PLF+Dmab组中大鼠终板的Po.N均显着增高（P<0.01）,而Po（op）和Po.V（tot）均显着降低（P<0.01）。3组织学检测及评分结果番红O固绿染色显示,Sham组髓核内充大量的脊索细胞和细胞外基质,终板结构完整有大量的软骨细胞,纤维环排列整齐有序,然而与之相反,OVX组、PLF组和OVX+PLF组髓核内脊索细胞及围绕脊索细胞的细胞外基质显着减少并且部分发生黏液样退变,终板钙化严重伴有新骨形成,纤维环稀疏紊乱。上述退变情况在OVX+PLF组中表现的更加突出。然而,在给予Dmab干预后上述变化被显着抑制。组织学评分结果显示,与Sham组相比,OVX组、PLF组和OVX+PLF组评分显着增高（P<0.05）,与PLF组相比,OVX+PLF组评分显着增高（P<0.05）,然而OVX组与OVX+PLF组之间无显着差异（P>0.05）。与OVX+PLF组相比,OVX+PLF+Dmab组评分显着降低（P<0.05）。4生物力学检测椎体压缩实验证实,与Sham组相比,在OVX组、PLF组和OVX+PLF组椎体极限应力（Maximum stress）、弹性模量（Elastic modulus）、极限负荷（Maximum load）及屈服应力（Yield stress）均显着降低（P<0.01）。这些变化在OVX+PLF组中表现的更为明显,然而与OVX+PLF组相比,OVX+PLF+Dmab组极限应力、弹性模量、极限负荷及屈服应力均显着增加（P<0.01）。5免疫组织化学染色与Sham组相比,OVX组、PLF组与OVX+PLF组大鼠髓核中SOX-9的表达水平均显着增高（P<0.01）。与OVX组和PLF组相比,OVX+PLF组中SOX-9的表达水平均显着增高（P<0.01）。然而,与OVX+PLF组相比,OVX+PLF+Dmab组中SOX-9表达水平显着降低（P<0.01）。与Sham组相比,OVX组、PLF组与OVX+PLF组大鼠髓核中CD24的表达水平均显着降低（P<0.01）。与OVX组和PLF组相比,OVX+PLF组中CD24的表达水平均降低（P<0.05）。然而,与OVX+PLF组相比,OVX+PLF+Dmab组中CD24表达水平显着增高（P<0.01）。结论:1.切除卵巢大鼠行自体髂骨移植横突间合并棘突钢丝固定的腰椎融合术可以导致ASDD的发生。该模型对阐述ASDD病理改变以及后续治疗干预提供较好的动物模型基础。2.雌激素减少诱发的骨质疏松加重ASDD,提示在腰椎融合术后邻近节段椎间盘退变的病理进展中骨质疏松是一种重要的危险因素。在卵巢切除合并腰椎融合后相邻节段椎间盘退变动物模型中,早期给予Dmab药物干预可以改善椎体骨质疏松,延缓终板软骨的骨化,维持椎体骨密度和保持骨小梁结构的完整性,提示Dmab是防治ASDD的一种潜在性药物。3.Dmab不仅可以有效维持椎体的骨密度,还能通过促进成骨形成来改善椎体和终板骨小梁微结构维持椎体生物力学的性能,同时保护椎间盘结构功能的完整性,进而延缓ASDD的病理改变。
二、细胞外基质的构成（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、细胞外基质的构成（论文提纲范文）
（1）细胞骨架与细胞外基质的力学建模与分析（论文提纲范文）
| 引 言 |
| 1 细胞骨架及细胞外基质的微观组成及属性 |
| 1.1 聚合物纤维的结构特征 |
| 1.2 聚合物纤维的力学性质 |
| 2 细胞骨架及细胞外基质的主要构型 |
| 2.1 交联类型 |
| 2.2 网络主要构型 |
| 3 细胞骨架及细胞外基质的力学行为 |
| 3.1 非线性力学响应 |
| 3.2 动态交联属性 |
| 3.3 主动材料属性 |
| 3.4 塑性、断裂和力学重构 |
| 3.5 代表性网络构型的力学行为 |
| 4 总结与展望 |
（2）基于“阳化气，阴成形”理论研究TGF-β1/Smads影响黄韧带肥厚的机制及模型的建立（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 黄韧带肥厚的机制及动物模型建立的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 TGF-β1/Smads信号通路与纤维化 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 基于“阳化气,阴成形”理论研究IL-1β、TNF-α和TGF-β1/Smads在LFH中的表达及相关性 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 标本收集 |
| 1.2 纳入与排除标准 |
| 1.3 影像学测量 |
| 1.4 主要器械、设备、试剂等 |
| 1.5 手术方式 |
| 1.6 标本的取材、运输等标准操作规程 |
| 1.7 HE染色与组织形态学观察 |
| 1.8 Masson染色与纤维化观察 |
| 1.9 免疫组化法检测两组黄初带IL-lp、TNF-α、TGF-β1/Smads (TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7)、Col1和Col3蛋白的定位、半定量表达 |
| 1.10 实时焚光聚合酶链式反应（Real-Time PCR)检测IL-1β、TNF-α、TGF-β1/Smads (TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7)、Col1、Col3&mRNA表达 |
| 1.11 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 一般资料 |
| 2.2 HE染色结果 |
| 2.3 Masson染色结果 |
| 2.4 免疫组化结果 |
| 2.5 Real-Time PCR结果 |
| 2.6 DLSS组内黄韧带厚度和各层纤维化分级的相关性分析 |
| 2.7 DLSS组内黄韧带厚度和各层弹性-胶原纤维比的相关性分析 |
| 2.8 DLSS组内黄韧带厚度和各层mRNA表达的相关性分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 炎症与纤维化是黄韧带肥厚的主要病理机制 |
| 3.2 黄韧带背侧层是退变的起点 |
| 3.3 基于“阳化气,阴成形”理论探讨黄韧带“炎症-纤维化”病理过程 |
| 3.4 基于“阳化气,阴成形”理论探讨DLSS的中医药治疗 |
| 3.5 其他 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 实验二 基于三种造模方法诱导大鼠黄韧带肥厚动物模型的建立与评价 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要器械、设备、试剂等 |
| 1.3 实验动物的分组与取材 |
| 1.4 实验动物的造模 |
| 1.5 影像学测量 |
| 1.6 HE染色与大鼠黄韧带厚度的测量 |
| 1.7 Masson染色与大鼠黄韧带纤维化观察 |
| 1.8 免疫组化法检测各组黄初带IL-1β、TNF-α、TGF-β1/Smads (TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7)、Col1、Col3蛋白的定位、半定量表达 |
| 1.9 免疫印迹法定性、半定量分析IL-1β、TNF-α、TGF-β1和Coll蛋白在各组黄韧带内表达 |
| 1.10 Real-Time PCR检测 IL-1β、TNF-α、TGF-β1/Smads (TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7)、Col1、Col3的mRNA表达 |
| 1.11 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 HE染色与大鼠黄韧带厚度的结果 |
| 2.2 Masson染色与大鼠黄韧带纤维化的结果 |
| 2.3 影像学测量结果 |
| 2.4 免疫组化结果 |
| 2.5 免疫印迹结果 |
| 2.6 Real-Time PCR结果 |
| 2.7 大鼠黄韧带与人增厚黄韧带的比较 |
| 2.8 模型成功率 |
| 3 讨论 |
| 3.1 大鼠黄韧带肥厚模型的建立方法 |
| 3.2 大鼠黄韧带肥厚的病理表现 |
| 3.3 机械应力是诱发或加速黄韧带肥厚的重要因素 |
| 3.4 基于“阳化气,阴成形”理论探讨大鼠黄韧带增厚模型的建立 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 不足与展望 |
| 创新点 |
| 致谢 |
| 附件 |
（3）基于细胞与细胞外基质形态结构特征探讨离心运动性骨骼肌过度使用损伤发生机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 前言 |
| 第2章 文献综述 |
| 2.1 骨骼肌过度使用性损伤概念诠释 |
| 2.2 骨骼肌过度使用性损伤引起的细胞外基质结构改变 |
| 2.3 骨骼肌过度使用性损伤与肌节横向张力传递变化 |
| 2.4 线粒体和胞膜窖功能与骨骼肌过度使用性损伤的关系 |
| 2.5 骨骼肌过度使用性损伤与肌卫星细胞的修复 |
| 2.6 骨骼肌过度使用性损伤的实践意义 |
| 2.7 研究方案 |
| 第3章 材料与方法 |
| 3.1 实验对象与方法 |
| 3.1.1 实验对象 |
| 3.1.2 实验对象分组与运动训练方案 |
| 3.1.2.1 实验对象分组 |
| 3.1.2.2 运动训练方案 |
| 3.1.3 标本取样 |
| 3.2 指标检测与方法 |
| 3.2.1 透射电镜观察骨骼肌超微结构变化 |
| 3.2.2 扫描电镜观察骨骼肌胞外基质结构变化 |
| 3.2.3 免疫组化检测Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原纤维 |
| 3.3 实验主要仪器和试剂 |
| 3.3.1 实验仪器及型号 |
| 3.3.2 实验主要试剂 |
| 3.4 统计分析 |
| 第4章 结果 |
| 4.1 4 周连续与间歇离心训练引起的骨骼肌超微结构变化 |
| 4.2 4 周连续与间歇离心训练引起的骨骼肌胞外基质结构变化 |
| 4.3 4 周连续与间歇离心训练引起的肌细胞横截面积变化 |
| 4.4 4 周连续与间歇离心训练引起的胞外基质胶原浓度与结构变化 |
| 4.4.1 4 周连续与间歇离心训练引起的Ⅳ型胶原纤维浓度与基底膜厚度变化 |
| 4.4.2 4 周连续与间歇离心训练引起的Ⅲ型胶原纤维浓度与肌内膜厚度变化 |
| 4.4.3 4 周连续与间歇离心训练引起的Ⅰ型胶原纤维浓度与肌束膜厚度变化 |
| 4.4.4 4 周连续与间歇离心训练引起的Ⅰ型胶原纤维浓度与Ⅲ型胶原纤维浓度比值变化 |
| 4.4.5 4 周连续与间歇离心训练引起的Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原纤维浓度相关性 |
| 4.4.6 4 周连续与间歇离心训练引起的基底膜、肌束膜和肌内膜厚度相关性 |
| 第5章 分析讨论 |
| 5.1 骨骼肌过度使用性损伤动物模型建立 |
| 5.2 过度使用损伤模型细胞-细胞外基质结构变化特征规律 |
| 5.2.1 不同时相骨骼肌细胞形态特征 |
| 5.2.2 不同时相骨骼肌基底膜结构特征 |
| 5.2.3 不同时相骨骼肌肌内膜和肌束膜结构特征 |
| 5.3 骨骼肌基底膜、肌束膜与肌内膜结构特征相关性 |
| 5.4 骨骼肌过度使用损伤发生机制 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的学术论文及研究成果 |
| 致谢 |
（4）circ-RBM33介导细胞外基质降解在腹主动脉瘤中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 1 腹主动脉瘤 |
| 1.1 腹主动脉瘤概述 |
| 1.2 腹主动脉瘤的发病机制和危险因素 |
| 1.3 腹主动脉瘤的治疗现状 |
| 2 细胞外基质降解与腹主动脉瘤 |
| 2.1 细胞外基质概述 |
| 2.2 细胞外基质降解对腹主动脉瘤的影响 |
| 3 circRNA与腹主动脉瘤 |
| 3.1 circRNA概述 |
| 3.2 circRNA与腹主动脉瘤的关系 |
| 3.3 circRNA对细胞外基质降解的影响 |
| 4 本课题研究目的及内容 |
| 第一部分 人腹主动脉组织全转录组测序及分析 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 测序数据的质量评估及序列比对 |
| 3.2 腹主动脉瘤组织与对照组织中差异表达的mRNA及功能预测 |
| 3.3 腹主动脉瘤组织与对照组织中差异表达lncRNA及其cis调控基因的功能预测 |
| 3.4 腹主动脉瘤组织与对照组织中差异表达circRNA |
| 3.5 构建circRNA、miRNA、mRNA互作网络 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分circ-RBM33调节细胞外基质降解的功能研究 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料与实验方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 qRT-PCR筛选circRNA |
| 3.2 验证circ-RBM33的环状结构 |
| 3.3 AngII刺激人VSMCs中circ-RBM33的上调表达 |
| 3.4 构建circ-RBM33过表达的VSMCs细胞 |
| 3.5 circ-RBM33过表达对ECM的降解的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分circ-RBM33在血管平滑肌细胞中调控机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料与实验方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 circ-RBM33潜在靶标miRNA的预测及表达 |
| 3.2 双荧光素酶报告实验验证circ-RBM33与miR-4268的结合位点 |
| 3.3 筛选并验证miR-4268的下游靶基因 |
| 3.4 circ-RBM33通过miR-4268调控靶基因EPHB2的表达 |
| 3.5 circ-RBM33通过miR-4268/EPHB2轴调控ECM降解 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 全文总结与展望 |
| 1.腹主动脉组织全转录组测序分析 |
| 2.circRNA调节细胞外基质降解 |
| 3.血管平滑肌细胞中,circ-RBM33通过调节miR-4268/EPHB2,影响AAA进展 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间研究成果 |
| 论文综述 腹主动脉瘤的研究进展及circRNA的调节作用 |
| 参考文献 |
（5）二叶式主动脉瓣钙化关键基因的生物信息学分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 研究材料 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.2.1 原始数据的处理: |
| 1.2.2 GO富集分析: |
| 1.2.3 KEGG富集分析: |
| 1.2.4 PPI网络构建: |
| 1.2.5 筛选hub基因: |
| 1.2.6预测hub基因的miRNA: |
| 1.2.7 构建miRNA-mRNA调控网络图: |
| 2 结果 |
| 2.1 DEGs |
| 2.2 GO富集分析及KEGG富集分析 |
| 2.3 hub基因 |
| 2.4 预测hub基因的miRNAs |
| 2.5 对DEGs及hub基因的验证 |
| 3 讨论 |
（6）软骨脱细胞细胞外基质3D生物打印支架负载髌下脂肪垫间充质干细胞修复兔软骨病损的相关研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 一、 骨性关节炎及软骨损伤的治疗现状 |
| 二、 组织工程学在软骨损伤修复领域的应用 |
| 三、 论文工作的提出 |
| 第一部分 髌下脂肪垫间充质干细胞及软骨脱细胞细胞外基质生物学特性的研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 第二部分 负载IPFP-ADSC的dCECM水凝胶支架的3D构建及其生物学特性的研究 |
| 第一节 dCECM复合水凝胶生物墨水制备及3D打印水凝胶支架的理化特性研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 第二节 3D生物打印负载IPFP-ADSC组织工程支架体外成软骨分化生物学特性研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 第三部分 3D生物打印负载IPFP-ADSC组织工程支架修复兔软骨缺损的实验研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 第四部分 总结与展望 |
| 一、本文工作总结 |
| 二、主要成果及创新点 |
| 三、不足之处及展望 |
| 参考文献 |
| 综述 脱细胞细胞外基质生物材料在组织工程中的应用 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表论文及科研工作情况 |
| 致谢 |
（7）多孔聚醚醚酮微球的制备、表面改性及在骨修复中的应用（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 骨再生的策略 |
| 1.2.1 骨结构的生物学原理 |
| 1.2.2 骨再生的机制 |
| 1.2.3 骨植入材料的设计 |
| 1.3 骨植入物的分类 |
| 1.3.1 自体移植物 |
| 1.3.2 同种异体移植物 |
| 1.3.3 异种骨移植 |
| 1.3.4 已塑形骨组织工程材料 |
| 1.3.5 可注射骨植入材料 |
| 1.4 多孔微球在骨修复中的应用 |
| 1.4.1 多孔微球的特征 |
| 1.4.2 制备多孔微球的材料与方法 |
| 1.4.3 多孔微球的应用 |
| 1.5 本论文的研究目标、内容及创新 |
| 1.5.1 研究目标 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 1.5.3 研究创新点 |
| 第2章 表面包被矿化细胞外基质的多孔PEEK微球的制备与表征 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料和仪器 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 仪器设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 液-液相分离的原理 |
| 2.3.2 表面光滑PEEK微球的制备 |
| 2.3.3 表面多孔PEEK微球的制备 |
| 2.3.4 表面光滑与多孔PEEK微球的表征 |
| 2.3.5 PEEK微球蛋白吸附能力测试 |
| 2.3.6 PEEK微球的亲水性能表征 |
| 2.3.7 表面包被矿化细胞外基质的多孔PEEK微球的制备与表征 |
| 2.3.8 浸提液细胞毒性检测 |
| 2.3.9 统计分析 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 光滑PEEK微球的表面与剖面微结构 |
| 2.4.2 多孔PEEK微球的表面与剖面微结构 |
| 2.4.3 多孔PEEK微球的FTIR表征 |
| 2.4.4 PEEK微球的亲水性表征 |
| 2.4.5 多孔PEEK微球的蛋白吸附能力分析 |
| 2.4.6 矿化细胞外基质的形貌观察和元素分析 |
| 2.4.7 表面包被矿化细胞外基质PEEK微球的热失重分析 |
| 2.4.8 浸提液细胞毒性 |
| 2.5 结论 |
| 第3章 表面包被矿化细胞外基质的多孔PEEK微球的体外生物相容性评估和体内成骨性能评估 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验仪器和材料 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 仪器设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞黏附形态荧光染色观察 |
| 3.3.2 细胞增殖检测 |
| 3.3.3 电镜下观察细胞形态和细胞外基质 |
| 3.3.4 脱细胞-再种植后的黏附荧光染色与增殖检测 |
| 3.3.5 碱性磷酸酶染色及活性检测 |
| 3.3.6 茜素红染色及钙定量检测 |
| 3.3.7 Runx2和Col-I实时荧光定量PCR检测 |
| 3.3.8 大鼠颅骨缺损模型的构建 |
| 3.3.9 Micro-CT数据重建及分析 |
| 3.3.10 组织切片染色观察 |
| 3.3.11 统计分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 细胞黏附形态和细胞外基质的分泌 |
| 3.4.2 细胞增殖 |
| 3.4.3 脱细胞-再种植后的黏附与增殖分析 |
| 3.4.4 碱性磷酸酶染色及活性分析 |
| 3.4.5 茜素红染色及定量分析 |
| 3.4.6 成骨相关基因分析 |
| 3.4.7 Micro-CT重建及分析评价 |
| 3.4.8 组织切片H&E及Masson染色分析 |
| 3.5 结论 |
| 第4章 多孔PEEK微球表面聚多巴胺涂层黏附IGF-1 和BMP-2 双生长因子的骨修复研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料和仪器 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 仪器设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 DA涂层及负载双生长因子的多孔PEEK微球的制备 |
| 4.3.2 DA涂层多孔PEEK微球的表征 |
| 4.3.3 ELISA法检测微球生长因子负载量及缓释行为 |
| 4.3.4 负载双生长因子多孔PEEK微球的体外生物相容性研究 |
| 4.3.5 负载双生长因子多孔PEEK微球的体内骨修复研究 |
| 4.3.6 统计分析 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 DA涂层多孔PEEK微球的表征 |
| 4.4.2 ELISA法检测微球生长因子负载量并评估缓释行为 |
| 4.4.3 体外成骨性能评估 |
| 4.4.4 负载双生长因子多孔PEEK微球的大鼠颅骨缺损修复 |
| 4.5 结论 |
| 第5章 结论 |
| 本研究的特色与创新之处 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（8）兔胫骨骨膜细胞膜片体外构建研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一部分 兔胫骨骨膜细胞的体外培养、鉴定及膜片构建 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 兔胫骨骨膜细胞膜片生物学功能的初步研究 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 骨组织工程种子细胞研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（9）碳水化合物磺基转移酶3在椎间盘退变中的作用及调控机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 椎间盘退变时CHST3 的表达差异及调控机制研究 |
| 一、实验对象和材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 第二部分 CHST3 影响椎间盘退变的作用研究 |
| 一、实验对象和材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 第三部分 CHST3 通过自噬调控椎间盘退变的机制研究 |
| 一、实验对象和材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 基因多态性对椎间盘退变的影响 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的文章 |
| 致谢 |
（10）狄诺塞麦对卵巢切除合并腰椎融合大鼠邻近节段椎间盘退变的作用及其机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 大鼠卵巢切除合并腰椎融合诱发邻近节段椎间盘退变模型的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 狄诺塞麦对卵巢切除大鼠合并腰椎融合诱发邻近节段椎间盘退变的作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 狄诺塞麦对卵巢切除合并腰椎融合诱发相邻节段椎间盘退变作用机制的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 椎间盘退变的病因和再生治疗相关研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、细胞外基质的构成（论文参考文献）
- [1]细胞骨架与细胞外基质的力学建模与分析[J]. 龚博,林骥,王彦中,钱劲. 应用数学和力学, 2021(10)
- [2]基于“阳化气，阴成形”理论研究TGF-β1/Smads影响黄韧带肥厚的机制及模型的建立[D]. 王宝剑. 中国中医科学院, 2021(02)
- [3]基于细胞与细胞外基质形态结构特征探讨离心运动性骨骼肌过度使用损伤发生机制[D]. 陈倩苇. 曲阜师范大学, 2021(02)
- [4]circ-RBM33介导细胞外基质降解在腹主动脉瘤中的作用及机制研究[D]. 王世知. 南昌大学, 2021(01)
- [5]二叶式主动脉瓣钙化关键基因的生物信息学分析[J]. 朱鹏程,张倩,卞金辉,章辉,倪布清,邵永丰. 实用临床医药杂志, 2021(09)
- [6]软骨脱细胞细胞外基质3D生物打印支架负载髌下脂肪垫间充质干细胞修复兔软骨病损的相关研究[D]. 吴俊. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(01)
- [7]多孔聚醚醚酮微球的制备、表面改性及在骨修复中的应用[D]. 孙烁. 吉林大学, 2021(01)
- [8]兔胫骨骨膜细胞膜片体外构建研究[D]. 徐燕梅. 福建医科大学, 2021
- [9]碳水化合物磺基转移酶3在椎间盘退变中的作用及调控机制研究[D]. 钟华建. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(01)
- [10]狄诺塞麦对卵巢切除合并腰椎融合大鼠邻近节段椎间盘退变的作用及其机制[D]. 孙琪. 河北医科大学, 2021(02)