一、抗HBsAg单链抗体靶向干扰素的构建及原核表达（论文文献综述）
张凡庆[1]（2020）在《猪源抗猪腹泻重要病原体单链抗体及其保护作用研究》文中研究表明仔猪腹泻占新生仔猪总死亡率的50%以上,是对养猪业造成经济损失的重要疾病之一。目前临床常见的仔猪腹泻病原包括猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）、传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus,TGEV）和产肠毒素大肠杆菌（enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC）。发病仔猪表现为腹泻、脱水、生长迟缓和最终死亡。PEDV和TGEV的预防措施是将疫苗免疫母猪,初生仔猪吸吮乳汁被动获得抗体。然而疫苗不能使所有母猪产生高水平乳源抗体,每头仔猪吮乳时间长短不同,很难保证仔猪都获得足够抗体抵抗病毒感染。ETEC的防控依靠抗生素,然而抗生素的大量使用容易导致ETEC产生耐药性。鉴于此,寻求有效对抗这些病原感染的新型免疫制剂显得极为重要。对于消化道病原感染,给动物口服特异性抗体或抗体衍生物是有效的防治方式。然而传统的抗体制剂存在均一性差、抗体来源与受治动物种属不同易产生免疫排斥等问题。随着生物技术的发展,基因工程抗体成为新型抗体制剂的研究热点,基因工程抗体中最具代表性的是单链抗体（single-chain fragment variable,scFv）。人类医学领域有关scFv治疗疾病的研究已很成熟,兽医领域的相关研究则刚刚开始,特别是猪源性scFv的研究以及scFv防治猪腹泻病原的感染鲜有报道,而这方面的研究对猪腹泻病原体新型防治策略的研发具有重要意义。基于此,本研究构建了猪源噬菌体-scFv库,筛选了抗猪源腹泻病原体（PEDV、TGEV和ETEC）scFv,并研究了scFv的生物学特性和保护作用。研究内容包括五个方面:1猪源性抗猪腹泻重要病原体scFv的获得为了获得抗猪腹泻重要病原体scFv序列,构建了猪源噬菌体-scFv库,库容量为5.5×107 cfu/m L(VH-Linker-VLκ)和7.2×107 cfu/mL（VH-Linker-VLλ）。从库中随机挑取12个克隆测序,证实构建的库来源于猪抗体序列,具有多样性。分别以PEDV、TGEV全病毒以及提纯的ETEC K88ac菌毛作为抗原,对构建的猪源噬菌体-scFv库进行筛选,获得了3株高亲和力的抗PEDV scFv（PZZ 21、PZZ 24和PZZ 35）、4株抗TGEV scFv（TZZ 14、TZZ 19、TZZ 43和TZZ 46）以及2株抗ETEC K88ac scFv（EZZ 3和EZZ 24）。将scFv序列进行原核表达及纯化,获得了具有活性的可溶性蛋白。这些猪源scFv应用于仔猪时避免了因抗体与受治动物种属不同而造成机体对抗体产生免疫排斥。2 scFv的生物学特性研究2.1抗PEDV和TGEV scFv的生物学特性研究为了研发抗PEDV和TGEV的新型scFv口服制剂,对针对PEDV和TGEV scFv的生物学特性进行研究。稳定性试验发现4℃保存时添加蛋白酶抑制剂延长了scFv的活性。亲和力试验证实这些scFv的亲和力均在107-108 M-1。分析scFv结合的病毒蛋白,发现PZZ 21、PZZ 24和PZZ 35均与PEDV S蛋白的S1亚基结合,TZZ 14、TZZ 19和TZZ 46与TGEV S蛋白结合,TZZ 43与TGEV N蛋白结合。病毒中和实验证实上述针对S蛋白的scFv具有抗病毒效果,而且将PZZ21、PZZ 24和PZZ 35联合使用的抗病毒效果好于单个scFv,TZZ 14、TZZ 19和TZZ 46也显示出协同作用。分析scFv影响PEDV感染细胞的阶段,发现PZZ21、PZZ 24和PZZ 35在病毒结合细胞时发挥抗病毒作用,而在入侵阶段无作用。2.2抗ETEC K88ac菌毛scFv的生物学特性研究ETEC K88ac菌毛介导细菌对肠上皮的黏附,是引起腹泻的先决条件。细胞黏附抑制实验证实抗ETEC K88ac的scFv EZZ 3和EZZ 24能抑制ETEC黏附IPEC-J2细胞,抑制率达51.9±2.7%和46.7±2.1%,EZZ 3和EZZ 24联合使用对细菌的黏附抑制率达62.6±1.5%。进一步建立了ETEC感染小鼠的腹泻模型,使用该模型分析了EZZ 3和EZZ 24对小鼠的保护作用。结果发现,与ETEC攻毒组相比,scFv处理组小鼠感染ETEC后仅表现轻度腹泻症状,肠道结构完整。此外scFv口服不会造成小鼠组织细胞损伤,不影响小鼠生长,具有安全性。3壳聚糖纳米scFv口服制剂的研制虽然上述研究证明抗PEDV和TGEV scFv在体外中和病毒感染,抗ETEC scFv对ETEC引起的小鼠腹泻具有保护作用,但仔猪消化道环境复杂,抗体口服后可能会受到胃部酸性环境和蛋白酶影响导致疗效降低。为了提高scFv在仔猪胃肠道稳定性,本研究以羧甲基壳聚糖为原料制备了p H响应性scFv纳米口服制剂（CMCS/CS-scFv）。通过优化投入比例和反应条件,得到的CMCS/CS-scFv粒径为292±21 nm,PDI为0.24±0.12。CMCS/CS-scFv纳米制剂眼观呈光泽的乳白色,透射电镜下呈现球形,大小均一。CMCS/CS-scFv能抵抗胃酸对scFv的破坏,其释放具有p H响应性,酸性环境下少量释放,碱性环境中快速释放。此外CMCS/CS-scFv对肠道细胞和仔猪没有毒性,具有安全性。本研究为开发scFv口服制剂的新剂型提供了科学依据。4纳米口服制剂CMCS/CS-scFv对仔猪病原性腹泻的保护作用研究为了验证CMCS/CS-scFv对仔猪腹泻的保护功能,首先比较了scFv和CMCS/CS-scFv对仔猪感染单一病原体的保护效果。PEDV的仔猪保护实验发现,CMCS/CS-PZZ（PZZ包括scFv PZZ 21、PZZ 24和PZZ 35）和PZZ灌服后对仔猪感染PEDV具有保护作用,而且CMCS/CS-PZZ处理后仔猪的腹泻指数显着低于口服PZZ（p<0.05）,显示出更好的保护效果。TGEV动物实验也证实CMCS/CS-TZZ（TZZ包括scFv TZZ 14、TZZ 19和TZZ 46）处理组对仔猪腹泻的保护效果好于TZZ处理组,粪便病毒载量显着低于TZZ处理组（p<0.05）。ETEC动物实验证实CMCS/CS-EZZ对仔猪感染ETEC提供保护,而且CMCS/CS-EZZ口服后保护效果好于EZZ。针对仔猪腹泻往往是多个病原混合感染,将CMCS/CS-scFv（包括PZZ、TZZ、EZZ）联合应用,发现CMCS/CS-scFv灌胃后粪便中病毒粒子和细菌数量显着低于攻毒组（p<0.05）,存活率高于攻毒组,说明CMCS/CS-scFv联合应用对病原混合感染具有保护效果,为临床大规模应用和制剂优化奠定了基础。5分泌表达scFv的乳酸乳球菌对仔猪病原性腹泻的保护作用研究scFv治疗仔猪腹泻时,其在肠道存留时间越长效果越好,为了使scFv在肠道持续释放,受乳酸菌活载体疫苗的启发,将抗猪腹泻病原体scFv与乳酸乳球菌（Lactococcus lactis,L.lactis）表达系统结合,构建了分泌表达scFv的重组L.lactis-scFv（scFv包括PZZ 21、TZZ 19和EZZ 3）。体外实验测定了重组L.lactis-scFv的酸碱耐受性,体内实验证实重组L.lactis-scFv靶向定殖在仔猪肠道黏膜并分泌scFv。细胞保护实验证实了分泌的抗病毒scFv对PEDV、TGEV的中和效果,抗K88ac scFv对ETEC黏附细胞的抑制作用。动物保护实验证实重组L.lactis-scFv口服后对仔猪感染腹泻病原产生保护作用,PEDV、TGEV或ETEC感染引起的腹泻症状减轻。本研究为治疗仔猪腹泻的新型scFv口服投递系统研发提供了科学依据。综上所述,本研究首先构建了猪源噬菌体-scFv库,从中筛选到具有活性的抗PEDV、TGEV和ETEC K88ac scFv;然后通过细胞实验分析了抗PEDV和TGEV scFv结合的病毒蛋白及中和病毒作用,细胞黏附抑制实验和小鼠保护实验证实了抗ETEC K88ac scFv防治腹泻的功能;进一步研制了抵抗胃部酸性环境和蛋白酶的纳米口服制剂CMCS/CS-scFv,增加了scFv口服稳定性;仔猪保护实验证实了scFv和CMCS/CS-scFv对PEDV、TGEV和ETEC引起的仔猪腹泻均具有保护作用,并且口服CMCS/CS-scFv具有比scFv更好的保护效果;将CMCS/CS-scFv联合应用,证实对仔猪腹泻病原混合感染提供保护;构建了分泌表达scFv的重组L.lactis-scFv,证实了重组L.lactis-scFv口服后对仔猪感染腹泻病原体具有良好的保护作用。本研究为仔猪腹泻病原的防治探索了新的途径,也为其它动物疫病的抗体制剂防治提供了有益借鉴。
黄爱国[2]（2020）在《靶向对虾白斑综合征病毒纳米给药系统研究》文中认为对虾白斑病（White Spot Disease,WSD）是由白斑综合征病毒（White Spot Syndrome Virus,WSSV）感染虾类致病的病毒性疾病,具有发病急、死亡率高等特点。虾类等无脊椎动物不具备适应性免疫系统,药物治疗和无特定病原（Specific Pathogen Free,SPF）苗种生产是防控WSD的有效手段。目前,尚无商品化药物控制WSD,开发抗WSSV药物十分必要。传统的虾类SPF苗种因培育周期长和成本高等因素,严重限制其推广应用。中草药具有资源丰富、环境友好、易降解等优点,是安全无公害水产原料药的理想来源。纳米靶向给药系统具有极易穿透组织屏障、靶向给药和提高药物疗效等优点,在提高药物疗效和高效制备SPF苗种研究方面具有重大意义。本研究以感染WSSV的克氏原螯虾为模型,从中草药中筛选抗WSSV活性的种类,并进一步对其主要活性成分进行抗WSSV活性评价和机制研究。在此基础上,选择单壁碳纳米管（SWCNTs）作为纳米载体,通过化学合成方法先后连接抗WSSV化合物和能够特异性识别WSSV的单链抗体,制备为纳米靶向给药系统,并于在体条件下,评价该系统抗WSSV效果。本研究取得结果如下:1. 中草药抗WSSV活性筛选利用实时荧光定量PCR和建立的绝对定量WSSV基因组拷贝数标准曲线,检测WSSV在克氏原螯虾体内的动态变化,结果显示:WSSV能够不同程度地感染克氏原螯虾鳃、血淋巴、后肠、肌肉和肝胰腺;其中,鳃组织中WSSV含量最高,而肝胰腺中WSSV含量最低;WSSV在克氏原螯虾体内的增殖曲线是典型的病毒一步生长曲线;WSSV极早期基因ie1、早期基因dnapol和晚期基因vp28的表达趋势与基因组DNA复制趋势一致。利用WSSV感染的克氏原螯虾为试验模型,对30种中草药粗提物进行抗WSSV活性筛选,结果发现处理浓度为100 mg/kg的栀子、杜仲、巴戟天、刺五加、黄精物、吴茱萸和白头翁的粗提物能够显着地抑制WSSV基因组复制,抑制率分别为92.31%、78.65%、69.00%、64.50%、62.01、57.87%和46.58%。2. 栀子粗提物抗WSSV活性研究利用WSSV感染的克氏原螯虾为试验模型,评价栀子粗提物抗病毒效果,结果发现:栀子粗提物呈浓度依赖性地抑制WSSV基因组复制;当处理浓度为100 mg/kg时,栀子粗提物对WSSV基因组复制抑制率高达90%以上;栀子粗提物能够显着抑制WSSV极早期基因ie1、早期基因dnapol和晚期基因vp28的表达;栀子粗提物（100mg/kg）处理7 d后,患病克氏原螯虾的累积存活率提高了60%。此外,栀子粗提物可以提高感染WSSV克氏原螯虾鳃组织中抗氧化相关基因（c Mnsod、m Mnsod、cat和gst）和凋亡相关基因（bax和bax inhibitor-1）的表达。利用液质联用仪,检测栀子粗提物中的京尼平苷（GP）、京尼平苷酸（GPA）和京尼平（GN）的含量,结果发现GP、GPA和GN的含量分别为171.93 mg/g、1.25 mg/g和0.46 mg/g。3. 栀子3种活性成分抗WSSV活性研究利用WSSV感染的克氏原螯虾为模型评价GP、GPA和GN的抗WSSV活性,结果发现:GP、GPA和GN能够显着抑制WSSV复制,而且处理浓度为50 mg/kg时抑制率均超过90%;使用浓度均为50 mg/kg的GP、GPA和GN分别处理10 d后,患病克氏原螯虾的累积存活率分别提高了70.0%、43.33%和50.0%。利用WSSV感染的南美白对虾为模型评价GP、GPA和GN的抗WSSV活性,结果显示:当处理浓度为50mg/kg时,这3种化合物对WSSV复制的抑制率均超过90%。GP、GPA和GN能够保护克氏原螯虾免遭氧化损伤和炎症反应。药代动力学研究表明:GP和GPA在克氏原螯虾和南美白对虾的体内的药代曲线相似;肝胰腺中药物含量最高,鳃组织中含量最少。4. GP、GPA和GN对WSSV蛋白功能的作用研究通过研究GP、GPA和GN对WSSV增殖的影响,结果发现这3种化合物主要影响WSSV复制早期阶段。通过构建WSSV囊膜蛋白VP19、VP24、VP26和VP28的真核质粒,经过细胞转染、荧光显微镜观察,结果显示:GP、GPA和GN有效地抑制VP19、VP24、VP26和VP28质粒在果蝇S2细胞内的表达,其中GN对VP28的抑制效果最为显着,表明这3种化合物能够作用于WSSV囊膜蛋白,进而对WSSV囊膜蛋白的表达和功能产生影响。GP、GPA和GN能够抑制STAT基因的表达,进而抑制极早期基因ie1、早期基因dnapol的转录,最终抑制WSSV的复制和晚期基因vp28的表达。5. 靶向WSSV纳米给药系统构建及效果评价通过基因重组技术构建特异识别WSSV的单链抗体P75E8的原核表达质粒和菌株。利用发酵和纯化等技术制备P75E8蛋白。Elisa检测表明P75E8蛋白与WSSV具有较高亲和力。细胞共转染试验发现,PE5E8从细胞核迁移至细胞质与WSSV囊膜蛋白VP28结合。酵母双杂交和Western blot结果表明,P75E8与VP28互作位点位于VP28460-612区域内。选取GPA、P75E8和SWCNTs分别作为抗WSSV药物、靶向配体和纳米载体,构建纳米靶向给药系统（SWCNTs-GPA-P75E8）。利用WSSV感染的克氏原螯虾模型,对GPA、SWCNTs-GPA和SWCNTs-GPA-P75E8进行抗病毒效果评价,结果发现SWCNTs-GPA-P75E8具有最强的抗WSSV活性。当用浓度为25 mg/kg的药物处理10 d时,GPA、SWCNTs-GPA和SWCNTs-GPA-P75E8处理组的患病克氏原螯虾的存活率分别为23.33%、36.67%和46.67%。药代动力学研究表明,SWCNTs-GPA-P75E8处理组的克氏原螯虾鳃组织中GPA含量显着高于GPA和SWCNTs-GPA处理组,而且减缓了药物代谢时间。浸浴处理南美白对虾仔虾的试验结果表明,GPA、SWCNTs-GPA和SWCNTs-GPA-P75E8能够不同程度的杀灭仔虾体内WSSV病毒,而且SWCNTs-GPA-P75E8的抗病毒效果显着高于GPA和SWCNTs-GPA。综上所述:栀子能够抑制WSSV复制,减少感染病毒克氏原螯虾的死亡率;栀子活性成分GP、GPA和GN能够通过间接抗病毒反应和直接作用病毒囊膜蛋白,发挥抗WSSV作用,具备开发为抗WSSV新型药物的潜力;纳米靶向给药系统能够通过靶向病毒蛋白VP28,实现WSSV的靶向治疗,提高药物的抗病毒效果,为高效抗WSSV和虾类SPF苗种生产提供一定的理论依据。
平芳[3]（2020）在《靶向乙型肝炎病毒核心蛋白定量检测方法的研究》文中研究说明乙型肝炎（hepatitis B）是一种由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）引起的全球范围的传染病,主要在肝脏发生病变。临床上,通过检测HBV血清标志物来辅助判断HBV感染与否、评价预后、治疗方案和药物反应等。近年来随着越来越多的研究,乙肝病毒核心蛋白（hepatitis B core protein,HBc）作为新型检测HBV手段受到广泛关注。HBc单体构成同型二聚体,进一步包裹前基因组RNA（pregenome RNA,pgRNA）和HBV聚合酶组装为正20面体的核壳体。核壳体腔内包含HBV松弛环状DNA（relax circular DNA,rcDNA）和病毒聚合酶的复合体,最终和HBV包膜蛋白（hepatitis B surface protein,HBs）相互作用形成成熟病毒颗粒。HBV感染肝脏机制的深入研究发现,HBc尤为重要。目前乙肝病毒学界的共识认为,HBc的表达量与肝细胞核内HBV共价闭合环状DNA（covalenty closed circular DNA,cccDNA）的功能活性正相关,通过定量检测HBc可以指示慢性乙肝患者体内cccDNA是否已经被清除或功能性失活。正对上述问题,我们在外源表达HBc新方法、靶向HBc特异性抗体和HBc定量检测这三方面内容开展相关研究工作。第一部分乙型肝炎病毒核心蛋白在枯草芽孢杆菌中的分泌表达目的:研究枯草芽孢杆菌中分泌表达重组HBc可行性。方法:1.HBc基因插入pBES-DNA穿梭质粒的MCS区域,获得pBES/HBc重组质粒。2.将pBES/HBc重组质粒酶切线性化后与信号肽DNA（Signal peptide library,SP DNA）库进行连接,连接产物转化stellar感受态细胞,收获全部阳性菌落并提取混合质粒。3.将混合质粒用化转的方法转入枯草芽孢杆菌RIK1285感受态细胞,检测信号肽,将包含不同信号肽的菌液进行放大培养,收集培养上清检测HBc分泌量。结果:重组HBc在枯草芽孢杆菌培养上清中存在,且有不同状态;经Western blot发现,Anti-HBc可以上清中重组HBc进行结合,具有高度特异性。结论:重组HBc在枯草芽孢杆菌中实现分泌表达,而且重组HBc蛋白表现出与天然状态类似的生物学活性。第二部分靶向乙型肝炎病毒核心蛋白的单链抗体库的构建目的:用T7噬菌体文库筛选的方法,建立靶向HBc单链抗体库。方法:1.将重组HBc/183和HBc/149作为抗原,免疫Balb/c雌性小鼠（6-8周）8周后,提取小鼠脾细胞mRNA,逆转录为cDNA。2.设计引物,cDNA作为模板,进行第一步PCR反应后,分别获得轻链可变区（VL）,重链可变区（VH）基因DNA片段,进行第二步重叠延伸PCR技术（SOE PCR）反应,将轻链和重链拼接得到单链抗体（ScFv）基因库。3.ScFv基因片段双酶切后与T7Select10-3b连接,构成原代重组T7噬菌体库。4.重组HBc/183和HBc/149作为固相抗原与重组T7噬菌体进行亲和筛选,通过3轮筛选,富集得到与HBc/183和HBc/149结合的噬菌体文库,挑选重组T7噬菌体进行ELISA检测,筛选出亲和性高的重组T7噬菌体,对ScFv进行测序。结果:通过igblast软件分析ScFv基因片段框架区（FR）和互补决定区（CDR）的氨基酸序列。高富集氨基酸序列用来制备ScFv抗体库。结论:得到与重组HBc/183和HBc/149高亲和性结合的ScFv氨基酸序列,为临床检测HBc作基础。第三部分靶向乙型肝炎病毒核心蛋白的抗体对的筛选目的:筛选出靶向HBc的抗体对,用于HBc定量检测。方法:1.制备靶向HBc不同基因片段的亲和性抗体,共23种,其中1-14号靶向HBc蛋白C端150-183氨基酸区域,23-31号靶向HBc蛋白N端1-149氨基酸区域。2.每个ELISA平板与除其自身之外的ALP标记抗体形成抗体对,采用固定在平板上的抗体-抗原-ALP标记抗体模式,检测HBc。3.PBS作为对照组,不同ng级别的HBc样本组。用化学发光的方法检测不同组合的抗体对的发光值,筛选高亲和性的抗体对。结果:进行统计学分析,从中选出亲和性较高的抗体对。结论:不同抗体组对于HBc蛋白的亲和性不同,不同抗体组对于HBc蛋白不同检测限的检测有统计学意义。
管玉[4]（2020）在《牛源抗金黄色葡萄球菌β溶血素单链抗体的筛选及保护作用研究》文中研究说明奶牛乳腺炎作为奶牛养殖业中发病率较高、造成巨大经济损失的疾病之一。金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,下文简称金葡菌）是导致奶牛乳腺炎的主要病原之一。β溶血素（βhemolysin,hlb）是金葡菌分泌的外毒素,可以协助金葡菌定植在牛乳腺细胞和造成乳腺细胞损伤。单链抗体（single chain fragment variable,scfv）是近年来受到高度重视的新型基因工程单价小分子抗体之一,研究和应用前景广阔。有研究表明,靶向阻断分泌性毒力因子可以为机体提供更有效的保护,通过筛选针对β溶血素的单链抗体并研究其保护作用对预防奶牛乳腺炎具有重要的科学意义和应用价值。本文针对金葡菌β溶血素的单链抗体筛选及其保护作用主要进行了以下几个方面的研究:1.重组β溶血素的表达、纯化及溶血活性验证。提取金黄色葡萄球菌ATCC25923的DNA为模板,PCR扩增编码β溶血素的基因,构建原核表达质粒p ET32a-hlb,诱导表达获得重组hlb蛋白。将重组hlb蛋白与2%奶牛红细胞孵育后,通过测定红细胞悬液离心后上清的OD450判定重组hlb的溶血活性。实验结果表明,重组hlb具有溶解奶牛红细胞的活性,溶血作用随β溶血素浓度增高而增强（P<0.05）。2.针对β溶血素的单链抗体的筛选及体外活性的验证。利用重组hlb蛋白从牛源单链抗体噬菌体文库中筛选并原核表达、纯化获得了针对β溶血素的单链抗体。将单链抗体分别与重组β溶血素和金葡菌培养物上清孵育后加入2%奶牛红细胞反应,测定红细胞悬液离心后上清OD450判定单链抗体体外抑制β溶血素溶血作用的活性。实验结果证明,单链抗体能显着抑制重组hlb蛋白的溶血活性（P<0.001）。单链抗体可以在一定程度上抑制金葡菌培养物上清的溶血作用（P<0.05）。3.单链抗体对金葡菌感染小鼠乳腺具有保护作用。单链抗体可以抑制金葡菌在小鼠乳腺中的定植和扩增,减轻乳腺组织损伤,调节乳腺局部免疫反应。乳腺组织细菌计数结果显示,金葡菌感染后48h后,阴性对照组乳腺组织内细菌数量增加,而青霉素和单链抗体预防后再感染金葡菌,小鼠乳腺组织中的细菌数量显着减少（P<0.05）。HE组织切片染色结果显示,金葡菌感染后阴性对照组乳腺腺泡结构破坏严重,炎性细胞大量浸润,青霉素和单链抗体预防组的小鼠乳腺组织损伤减轻,腺泡结构较完整,腺泡内炎性细胞浸润数量减少。抗体生物安全组乳腺腺泡结构完整,腺泡内有少量炎性细胞浸润。巨噬细胞免疫组化染色结果显示,与空白对照组相比,金葡菌感染小鼠后,阴性对照组乳腺组织中巨噬细胞数量显着增加（P<0.05）。青霉素和单链抗体预防组的乳腺组织中巨噬细胞数量与阴性对照组相比显着减少（P<0.05）,且集中在腺泡破坏的部位。抗体生物安全组巨噬细胞数量显着增加（P<0.05）单链抗体调节了乳腺组织局部细胞因子的表达。与阴性对照组相比,青霉素和单链抗体预防组的小鼠乳腺组织的IL-18含量显着减少（P<0.05）,而青霉素预防组IL-8的含量显着增加（P<0.05）,单链抗体预防组IL-8含量有降低的趋势,但无显着差异。抗体生物安全组IL-8和IL-18含量显着升高（P<0.05）。综上所述,抗金葡菌β溶血素单链抗体可以通过靶向阻断β溶血素的作用,抑制金葡菌在乳腺中的扩散,同时调节巨噬细胞浸润和细胞因子的表达在一定程度上保护乳腺感染金黄色葡萄球菌。
刘丽枝[5]（2019）在《猪圆环病毒2型Cap蛋白与重组单链抗体APCH1的融合表达及其免疫原性研究》文中研究表明猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）是严重危害我国养猪业的重要病原之一。目前对PCV2的防控以疫苗免疫为主,市场上商品化PCV2疫苗有很多,其中大多数疫苗需要添加佐剂来提高免疫效应,传统佐剂因其具有强大的免疫功效得到广泛的应用,但同时也会引起一些毒副反应,对机体产生潜在的健康风险。近来,有研究显示APCH1（Antigen presenting cells homing 1）重组单链抗体可以携带抗原靶向至抗原呈递细胞（APCs）,并与主要组织相容性复合体II类分子（MHCII）的抗原位点结合,形成抗原肽-MHCII分子复合物,然后转运至APCs表面供T淋巴细胞受体（TCR）识别,从而显着增强亚单位疫苗的免疫效果。鉴于此,本研究利用杆状病毒表达载体系统,将APCH1与PCV2 Cap蛋白进行融合表达,构建了具有分子佐剂活性的PCV2亚单位基因工程疫苗,并在动物体内对所构建的疫苗进行了免疫效力评价。主要研究内容如下:1.重组杆状病毒rBV-APCH1-Cap的构建及体外表达人工合成重组单链抗体APCH1基因以及昆虫细胞密码子优化的PCV2 ORF2基因（编码Cap蛋白）,以此为模板,通过PCR扩增得到APCH1基因以及去除核定位序列的ORF2基因（△41ORF2）,分别通过酶切、连接,构建双拷贝、融合表达APCH1-△41ORF2基因的重组转移质粒pFastBac Dual-D-ACPH1-△41ORF2。随后将该重组转移质粒转化DH10Bac大肠杆菌,通过蓝白斑筛选阳性克隆,提取重组rBacmid-APCH1-△41ORF2基因组,利用PCR证实APCH1-△41ORF2基因已经整合到重组杆状病毒Bacmid中。将Bacmid转染Sf9昆虫细胞,获得了重组杆状病毒rBV-APCH1-Cap。间接免疫荧光和Western blot实验证实,该重组杆状病毒能在昆虫细胞中高效表达APCH1-Cap重组蛋白。2.猪圆环病毒2型Cap蛋白双抗夹心ELISA定量检测方法的建立为了方便快捷地检测重组杆状病毒表达的PCV2 Cap蛋白含量,构建了分泌表达PCV2 Cap蛋白的重组杆状病毒rBV-Cap-His,将表达的蛋白经镍柱纯化后获得浓度为0.37 mg/mL的纯化蛋白。以此纯化蛋白免疫小鼠获得两株针对PCV2 Cap蛋白的特异性单克隆抗体2D3,3E10。将单抗2D3和3E10分别作为包被抗体和检测抗体,以纯化的蛋白为抗原,建立了检测PCV2 Cap蛋白含量的双抗夹心ELISA方法,并根据不同含量Cap蛋白的OD630值绘制了标准曲线。用建立的ELISA方法和Western blot同时对3份纯化的Cap蛋白样品进行平行检测,根据标准曲线和ImageJ灰度分析分别确定两种方法所检测的蛋白的含量。结果显示两种检测方法获得的蛋白含量具有良好的相关性,证实所建立的双抗夹心ELISA方法是可靠的,可以用于PCV2 Cap蛋白的定量。3.重组亚单位疫苗APCH1-Cap在小鼠体内诱发的保护性免疫为了评估APCH1的分子佐剂效应,本研究比较了分子佐剂亚单位疫苗APCH1-Cap与常规亚单位疫苗Cap蛋白的免疫原性的差异,分别以2μg/只、20μg/只的剂量免疫BALB/c小鼠,结果表明APCH1-Cap诱导的ELISA抗体水平以及IFN-γ、IL-4表达量均显着高于Cap蛋白免疫组,且免疫反应与接种剂量呈正相关。攻毒实验进一步表明,分子佐剂亚单位疫苗APCH1-Cap在小鼠体内诱导的中和抗体显着高于常规亚单位疫苗Cap蛋白免疫组。组织病理学结果表明,攻毒对照组小鼠脾小结和淋巴小节中有少量淋巴细胞坏死,脾巨噬细胞可见,分子佐剂亚单位疫苗APCH1-Cap免疫组小鼠组织结构完整,未见明显粒细胞浸润。这些结果表明分子佐剂APCH1有助于增强Cap蛋白诱导的体液免疫反应和细胞免疫反应。综上所述,与常规亚单位疫苗Cap蛋白相比,分子佐剂亚单位疫苗APCH1-Cap可以通过APCH1的靶向作用,增强抗原呈递细胞的抗原加工处理与呈递作用,有效激发小鼠产生更强的体液免疫和细胞免疫应答,进而发挥更有效的免疫保护。本研究将为新型高效的猪圆环病毒疫苗研究奠定良好的实验基础,此外,靶向MHCII分子的疫苗设计策略也将为其他病原微生物疫苗研究提供借鉴。
熊佳妮[6]（2019）在《基于南瓜蛋白和曲妥珠单抗的免疫毒素的制备及抗肿瘤作用研究》文中进行了进一步梳理研究目的:通过化学交联曲妥珠单抗和重组南瓜蛋白构建免疫毒素T-CUS245C,以增强HER-2靶向治疗疗效。基因工程方法将曲妥珠单抗可变区基因与南瓜蛋白基因序列通过连接子融合,构建HER-2单链抗体（Ts）重组免疫毒素Ts/CUS。检测T-CUS245C及Ts/CUS的体外抗肿瘤活性,并研究T-CUS245C内化作用及其同药效的关系,同时研究Ts/CUS同抗PD-1单克隆抗体联合在体外对肿瘤细胞表达PD-L1的影响。通过上诉研究了解以南瓜蛋白为毒素靶向HER-2受体的免疫毒素的药效、及其同其他药物联合应用的可能性,旨在改善曲妥珠单抗药效,提高其抗肿瘤作用,为拓宽HER-2靶向治疗窗提供理论基础以及实验依据。研究方法:1.重组南瓜毒素CUS245C的表达鉴定原核表达系统表达,Ni-柱亲和纯化CUS245C;质粒酶切,SDS-PAGE,Western Blot鉴定表达产物;2.抗CUS245C单克隆抗体的制备杂交瘤技术表达小鼠源性抗CUS245C单克隆抗体,Protein G亲和层析柱亲和纯化;3.T-CUS245C的化学交联SPDP巯基化曲妥珠单抗,DTT解聚CUS245C;交联反应后以透析法去除游离CUS245C,镍柱纯化得T-CUS245C;4.Ts的表达鉴定PCR酶切连接构建pET-32a（+）-Ts-His原核表达载体;流式细胞技术鉴定表达产物抗原亲和力及特异性,确保后续同南瓜毒素融合表达的准确性;5.Ts/CUS的构建、表达及纯化（GGGGS）3连接子连接CUS和Ts基因序列,PCR扩增,酶切连接入pET-32a（+）原核表达载体,IPTG诱导表达,Ni+柱亲和纯化;6.T-CUS245C和Ts/CUS的鉴定SDS-PAGE和Western Blot分别鉴定T-CUS245C和Ts/CUS分子量及其性质;流式细胞技术鉴定人源性肿瘤细胞BT-474、SK-BR-3、SK-OV-3、MCF-7以及MDA-MB-231胞膜上HER-2的表达情况,并检测T-CUS245C和Ts/CUS对HER-2阳性细胞的结合活性;流式细胞术检测不同浓度药物诱导细胞的凋亡情况;7.T-CUS245C和Ts/CUS的体外抗肿瘤活性SRB方法分别检测T-CUS245C和Ts/CUS对HER-2表达程度不同的各细胞的增值抑制率;8.T-CUS245C内化作用的检测FITC标记抗CUS245C抗体,普萘洛尔和洛利普兰处理细胞,利用荧光共聚焦显微镜对T-CUS245C内化情况及细胞器定位情况进行检测并观察上诉两种药物对细胞内化T-CUS245C作用的改变,探究改变内化作用对T-CUS245C抗肿瘤药药效影响;9.Ts/CUS联合Keytruda对肿瘤微环境的影响人外周血淋巴细胞同肿瘤细胞共培养,观察Ts/CUS联合Keytruda应用对肿瘤细胞PD-L1表达的影响和对淋巴细胞分泌IFN-γ的作用;研究结果:1.流式细胞术检测上述肿瘤细胞系HER-2表达情况:BT-474 HER-2表达最强,SK-OV-3次之,SK-BR-3较弱,而MCF-7和MDA-MB-231因抗原阴性被作为对照组细胞;2.大肠杆菌成功表达CUS245C,镍离子亲和层析法纯化后,纯度高;3.免疫毒素T-CUS245C偶联成功。SDS-PAGE结果显示T-CUS245C存在不同的偶联分子比纯度高。Western blot明确交联产物条带中含有CUS。流式细胞技术显示,T-CUS245C对HER-2阳性细胞亲和力未受交联影响并具有诱导细胞凋亡的作用;4.Sulforhodamine B检测T-CUS245体外细胞增殖抑制作用。结果显示,和曲妥珠单抗、CUS245C或曲妥珠单抗+CUS245C相比较,交联免疫毒素T-CUS245对HER-2阳性细胞株（SK-OV-3、SK-BR-3和BT-474）的增殖抑制作用明显,呈剂量依赖性和时间依赖性,72h的IC50分别为0.07 nM、0.67 nM、0.37 nM、;120 h的IC50分别为0.005 nM、0.03 nM、0.04 nM。对HER-2阴性细胞株MCF-7和MDA-MB-231则无明显的增殖抑制作用;5.荧光共聚焦显微镜显示随时间推移,T-CUS245C逐渐进入HER-2阳性细胞胞质,并定位于溶酶体。但无法进入HER-2阴性细胞中。CUS245C内化效应不明显;6.T-CUS245C内化过程可被普萘洛尔促进,这一促进作用可被洛利普兰中和。SRB显示促进T-CUS245C内化可增强其体外抗肿瘤作用,但给予磷酸二酯酶PDE4抑制剂洛利普兰后,T-CUS245C细胞毒作用随之减弱;7.Ndel/Xhol酶切及质粒DNA测序结果表明成功构建HER-2scFv重组载体;经SDS-PAGE显示表达产物分子量约为25 kDa,流式细胞技术证明表达产物对能够特异性结合抗原,解离常数Kd值为119.6 nM,并且结合抗原的位点同曲妥珠单抗相同;8.质粒DNA测序及Ndel/Xhol酶切鉴定表明成功构建Ts/CUS重组载体,经SDS-PAGE显示表达产物分子量约为55 kDa,蛋白表达纯度高,Western Blot进一步验证表达产物性质。流式细胞技术检测Ts/CUS同HER-2scFv比,对HER-2阳性细胞亲和力未受改造影响;流式细胞技术体外初测药效证明Ts/CUS具有诱导细胞凋亡的作用;9.Sulforhodamine B检测Ts/CUS体外细胞增殖抑制作用。结果显示,同Ts相比,Ts/CUS对SK-OV-3、SK-BR-3和BT-474的增殖抑制作用明显,且呈剂量依赖性和时间依赖性。其作用72h的IC50分别为0.43nM、1.8 nM、8.79nM,120h的IC50分别为0.15nM、0.37nM、1.82nM,远低于CUS245C对这几株细胞的IC50;10.在体外淋巴细胞/肿瘤细胞共培养体系中,应用Ts/CUS联合Keytruda后,对SK-BR-3细胞的杀伤作用较无药物处理组、单独应用Ts/CUS组和单独Keytruda组升高,差异有统计学意义（P<0.05）。流式细胞技术显示CD3CD4T淋巴细胞百分比升高,ELISA提示培养液中IFN-γ和IL-2均有升高,Ts/CUS联合Keytruda组升高最为明显,IFN-γ升高较IL-2显着。结论1.重组南瓜蛋白CUS245C具有细胞毒作用,并能够同曲妥珠单抗通过化学交联的方法构建成免疫毒素T-CUS245C,简化交联步骤,提高产物产量和纯度;2.通过化学交联,成功构建高产,高亲和的免疫毒素T-CUS245C;3.T-CUS245C具有体外抗肿瘤活性强,特异性高的特性;4.T-CUS245C可内化进入细胞质,定位于溶酶体中,这一过程可被普萘洛尔增强,内化速率的增加或减弱与T-CUS245C细胞毒作用相关;5.基因工程技术成功构建单链抗体免疫毒素Ts/CUS;6.Ts/CUS均具有体外抗肿瘤活性强,特异性高的特性;7.Ts/CUS联合Keytruda可体外激活淋巴细胞,促进其表达IFN-γ,提高抗肿瘤效应。
刘晶[7]（2019）在《基于FnBPA和CD11c单链抗体的侵入型乳酸菌构建及其分子免疫机制研究》文中提出猪流感（Swine influenza,SI）是由猪流感病毒（Swine influenza virus,SIV）引起的一种急性、高度接触性呼吸道传染病,其特征为突发咳嗽、呼吸困难、发热及迅速转归。SIV是一种球状结构的单股负链RNA分节段的病毒。其中血凝素（Hemagglutinin,HA）是SIV重要的膜蛋白,可以刺激机体产生中和抗体。目前,流感疫苗主要有灭活疫苗、减毒疫苗、基因工程活疫苗等,以乳酸菌作为粘膜疫苗递送载体也有研究,但递送抗原效率有待加强。本研究以植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum,L.plantarum）NC8株作为宿主菌,构建两种侵入型L.plantarum表达载体:一种是表达金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的侵袭素,即纤连蛋白结合蛋白A（Fibronectin binding protein A,FnBPA）;另一种是表达针对CD11c的单链抗体（single-chain variable fragment against CD11c,scFv-CD11c,简称aCD11c）。使用两种新型侵入型乳酸菌递送载体,以SIV的HA作为保护性抗原,探索其分子免疫机制。首先,我们构建了一株表面展示FnBPA的侵入型L.plantarum NC8-pSIP409-FnBPA。使用该菌株感染猪小肠上皮细胞（IPEC-J2）后,发现其对细胞的粘附与侵袭率分别为1.41%和0.15%,大约是空载体组的2倍和5倍。同时,将上述菌株与小鼠骨髓源树突状细胞（Bone marrow-derived dendritic cells,BMDCs）共培养,使用流式细胞术（Flow cytometry,FCM）检测菌株对BMDCs活化并以荧光定量PCR检测相应mRNA的表达情况。结果表明菌株NC8-pSIP409-FnBPA显着增强了BMDCs表面CD40和CD80表达水平（P<0.001）,同时基因IL-6和MyD88 mRNA的表达水平也显着提高（P<0.001）。同样,使用上述菌株免疫BALB/c小鼠,评价其免疫调节特性。结果显示NC8-pSIP409-FnBPA显着刺激派尔氏淋巴集结（Payer’s patches,PPs）中DCs的活化（P<0.001）以及提高脾脏CD4+T细胞中IL-4+（1.72%,P=0.0037）和IL-17A+（2.07%,P=0.0079）细胞百分比;ELISA结果表明血清中IL-4（P=0.0012）和IL-17A（P<0.001）的含量也显着增加。同时与空载体相比,NC8-pSIP409-FnBPA显着增加了小鼠肠系膜淋巴结（Mesenteric lymph nodes,MLN）（P<0.001）和PP结（P<0.001）中B220+B细胞数量并提高了FnBPA特异性IgG（1.72倍）和分泌型IgA（sIgA）（2.41倍）抗体滴度。其次,我们又构建一株表面展示表达aCD11c的靶向DCs的L.plantarum（NC8-pSIP409-aCD11c）。使用该菌株刺激BMDCs,发现该菌株对BMDCs的粘附与侵袭率分别为36.17%和2.23%,为空载体组的1.56倍和2.42倍。进而将携带真核质粒pValac-GFP的NC8-pSIP409-aCD11c菌株与BMDCs共培养36h后,使用FCM检测BMDCs中GFP表达以确定菌株对pValac-GFP的递送效率,结果表明:该菌株能显着增强BMDCs中GFP表达（P=0.0110）。将上述携带pValac-GFP的菌株口服免疫小鼠,免疫后PP结和MLN中GFP的表达在不同时间点均有所升高。此外,NC8-pSIP409-aCD11c菌株也能有效促进MLN中DCs的分化、成熟以及增加CD4+T细胞中IL-4+和IL-17A+细胞的百分比,同时提高PP结中B220+IgA+B细胞的含量。再次,我们使用上述两种侵入型载体表达了SIV的HA抗原,构建了三株乳酸菌分别为NC8-pSIP409-pgsA’-HA（HA）、NC8-pSIP409-FnBPA-pgsA’-HA（FnBPA-HA）和NC8-pSIP409-aCD11c-pgsA’-HA（aCD11c-HA）。将上述菌株免疫BALB/c小鼠,结果发现,与空载体组相比,HA组、FnBPA-HA组和aCD11c-HA组均能促进脾脏中DCs的活化和成熟,脾脏和MLN CD8+T细胞中IFN-γ+和穿孔素的表达以及PP结中B220+IgA+B细胞的产生;同时ELISA结果表明:与空载体组相比,表达HA的三株菌株免疫后均能显着提高小鼠血清中特异性IgG（2.28倍）及粪便（2.37倍）和气管冲洗液中sIgA（2.39倍）的抗体滴度,且均能产生中和抗体;将BALB/c小鼠感染10×LD50的流感病毒A/PuertoRico/8/1934（H1N1）,在感染后第7天,与HA组和FnBPA-HA组相比,aCD11c-HA组显着提高MLN中CD8+T细胞中IFN-γ+（P<0.001）和穿孔素（P<0.001）的表达,具有一定的抗病毒作用;FnBPA-HA组和aCD11c-HA组对IV的保护率为60%,HA组为40%。最后,探讨了aCD11c-HA乳酸菌在抗H1N1亚型IV中的分子免疫机制。以aCD11c-HA乳酸菌刺激BMDCs 12 h后,使用FCM检测菌株对BMDCs分化的影响,结果表明aCD11c-HA菌株显着促进BMDCs的活化。ELISA检测上述细胞上清中细胞因子的表达,发现aCD11c-HA菌株促进IL-12P70、抑制IL-6的分泌;分选未免疫小鼠脾脏的CD4+和CD8+T细胞,与上述激活的BMDCs共培养48 h后,使用FCM和ELISA分别检测细胞内IFN-γ+和穿孔素的表达及细胞分泌上清中IFN-γ的含量,发现aCD11c-HA菌株增强了分选CD4+T细胞中IFN-γ+（4.33%）以及CD8+T细胞中IFN-γ+（7.68%）和穿孔素（17.50%）的表达,同时促进细胞因子IFN-γ的分泌。与上一致,体内检测了脾脏和MLN中HA特异性CD8+T细胞中IFN-γ+（P<0.001）和穿孔素（P<0.001）的表达,aCD11c-HA组显着升高;并且aCD11c-HA组能显着促进脾脏T细胞的增殖（P<0.001）。使用磁珠分选免疫后各组小鼠的脾脏CD8+T细胞尾静脉回输NOD/Lt-SCID小鼠,24 h后感染5×LD50的IV,结果显示aCD11c-HA组的CD8+T细胞与HA组相比能延长NOD/Lt-SCID小鼠寿命2天,具有一定的保护作用。本研究构建了基于FnBPA蛋白及scFv-CD11c的两种侵入型植物乳杆菌,分别共表达了SIV的HA蛋白,与单表达HA的菌株相比,上述菌株免疫BALB/c小鼠后能显着增加对IV的攻毒保护率,尤其以scFv-CD11c共表达组在增强机体免疫反应方面更佳。进而通过FCM、流式分选、过继回输NOD/Lt-SCID小鼠等手段证实了aCD11c-HA菌株可增强病毒特异性CD8+IFN-γ+T细胞及穿孔素表达,初步揭示了靶向DCs的侵入型乳酸菌载体疫苗引起机体免疫反应的分子机制,为开发新型乳酸菌载体疫苗奠定了基础。
朱文莉[8]（2019）在《治疗视神经脊髓炎全人源抗C5单链抗体的研究》文中进行了进一步梳理研究目的:视神经脊髓炎（Neuromyelitis optica,NMO）谱系疾病（Neuromyelitis optica spectrum disorders,NMOSD）是一种中枢神经系统（Central nervous system,CNS）自身反应性炎性脱髓鞘疾病,主要累及脊髓和视神经,还可累及脑实质。研究表明NMO的主要病理特征为水通道蛋白-4（Aquaporin 4,AQP4）自身抗体（AQP4-immunoglobulin G,AQP4-IgG）结合星形胶质细胞表面的AQP4后,激活补体,导致一系列炎症反应,造成星形胶质细胞丢失、少突神经胶质细胞受损和神经元死亡。目前NMO的治疗方式主要是免疫调节及血浆置换,但患者仍有较高的死亡率或严重的后遗症。单克隆抗体用于治疗NMO正受到越来越多的关注,例如,利妥昔单抗（Rituximab）、依库珠单抗（Eculizumab）和托珠单抗（Tocilizumab）等单克隆抗体药物已经进入临床试验阶段,部分抗体药物已经展现出较好的临床效果。但是,当前开展临床试验的该类药物多数为鼠源的单克隆抗体,长期应用有引起患者的人抗鼠免疫原性反应（Human anti-mouse anti-antibody,HAMA）的潜在风险。本研究的目的是通过体外噬菌体展示技术从全人源单链抗体库中筛选出能够特异性结合补体C5（Complement C5,C5）的单链抗体（Single-chain variable fragment,scFv）,并明确其对NMO疾病模型的治疗效果。研究方法:本研究利用噬菌体展示体外固相筛选技术从噬菌体抗体库(6×1010)中筛选能够特异性结合C5的单链抗体。经过5轮的筛选（吸附-洗脱-扩增）,随机挑选了239个噬菌体克隆,通过酶联免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）验证其与补体C5的结合能力和结合特异性。根据ELISA多次重复的实验结果,选择在A450 nm数值较高的部分克隆进行核酸序列测定,使用DNAMAN进行序列多样性分析和序列比对,确定重复序列较高的阳性克隆。将重复序列最高的3个基因插入到原核表达载体pET30a（带有his标签）中。在低温（16°C）条件下培养,使用异丙基硫代半乳糖苷（Isopropylβ-D-Thiogalactoside,简称IPTG）诱导单链抗体基因在大肠杆菌BL21中可溶性表达。离心收集菌体后进行蛋白纯化,经过亲和层析、DEAE层析、Butyl层析一系列的纯化得到纯度在90%以上的可溶性单链抗体;用超滤管浓缩蛋白浓度至40 mg/mL用于后续实验;通过SDS-PAGE变性胶观察蛋白的片段大小,应用Western Blot、ELISA法鉴定可溶性单链抗体与补体C5结合的特异性;进一步用Biacore T200进行单链抗体与C5结合的亲和力和浓度依赖情况的检测,从而确定单链抗体的亲和力与补体C5的结合情况。挑选特异性较好的单链抗体作用于NMO体外和动物实验模型以明确目标单链抗体对NMO的治疗效果:利用AQP4-IgG和人补体（human complement,hC）作用于稳定表达AQP4的中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamsters ovary,CHO）模拟NMO的体外实验模型,通过LIVE/DEAD染色的方法验证筛选得到的单链抗体对NMO细胞模型细胞毒性的影响;选择脑实质注射NMOSD血清阳性患者的抗体(IgGNMOSD)和人补体在体内模拟视神经脊髓炎的发病情况,通过相关组织染色确定病灶及炎症细胞的变化,并进一步明确筛选得到的单链抗体对NMO的保护效果。结果:1.经过5轮噬菌体筛选得到了8个抗体序列（C5B3、C5B35、C5B98、C5B106、C5A6、C5A102、C5A121、C5A152）。将同源性最高的3个序列原核表达后进行一系列纯化,获得了纯度在90%以上的可溶性单链抗体。2.对纯化后的可溶性单链抗体（C5B3、C5A6、C5B35）进行了体外功能验证。结果表明,C5B3明显减少了稳定表达AQP4的CHO细胞的补体依赖性的细胞毒性作用,明显减少了膜攻击复合物的形成及死亡细胞的数量,且该作用具有明显的C5B3浓度依赖性。3.对单链抗体C5B3进行了体内功能验证。在NMO动物模型中,C5B3明显减小了脑实质注射IgGNMOSD和人补体引起的病灶体积和炎症细胞的浸润,并且能够减少体内膜攻击复合物的形成。结论:通过对全人源性噬菌体抗体库的筛选获得了特异性结合补体C5的单链抗体,经过体外及体内实验证实得到的1个单链抗体（C5B3）能够减少AQP4-IgG和人补体造成的细胞毒性,对NMO动物模型也能发挥一定的保护作用。
王玉娇,卢雪梅,金小宝,朱家勇[9]（2015）在《肝靶向干扰素的研究进展》文中提出干扰素是一种具有广泛抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的可溶性蛋白,是目前治疗病毒性肝炎、肝癌的疗效药,被广泛应用于临床。但因其在肝脏中富集较少,肾脏清除率很高,导致药物有效浓度较低从而影响治疗效果。本文对肝靶向干扰素的研究进展进行综述。
刘伟侠[10]（2012）在《显性负性突变体融合蛋白PreS2-TLM-ScFv-HBcDN抑制乙肝病毒复制的研究》文中提出背景病毒性疾病是人类健康面临的严重威胁。在许多老的病毒性疾病时有发病的同时,新的病毒,特别是致死性强的新毒株不断出现,有的甚至会形成暴发式流行。在新出现的病毒性传染病面前,人群缺乏免疫力,而且短时间内也找不到有效的预防、治疗和控制办法。临床上使用的抗病毒治疗药物（干扰素）虽然疗效明显,但是存在一定的副作用。基因治疗策略在体外具有明显的抑制病毒复制作用,充分发挥基因治疗的抗病毒优势,建立一种能促使治疗分子高效、靶向进入病毒感染细胞的在体给药方法具有十分重要的意义,但由于缺乏有效特异的输送载体,基因治疗抗病毒策略未得到深入研究。细胞穿膜肽（cell-penetrating peptides, CPP）可以高效的跨过细胞膜并把所携带的生物活性分子运送至细胞内。HBV表面蛋白PreS2结构域中包含一段具有CPP特性的转位基序（translocation motif, TLM）,位于41-52氨基酸（PreS2-TLM）, PreS2-TLM可不依赖于受体和转运蛋白非能量依赖性地将与其融合表达的蛋白带入细胞质内。单链抗体（single chain Fv, ScFv）分子量虽小,但是保留了与抗原结合的特异性,将治疗分子与ScFv进行偶联或融合后可引导治疗分子高浓度靶向聚集于抗原表达的细胞表面。基因治疗中,为了保证治疗分子的靶向结合和高效性进入靶细胞,可将CPP和特异性ScFv融合构成可穿过细胞膜的抗体,即靶向穿膜体。在HBV感染的肝细胞表面表达有HBV表面抗原（HBV surface antigen, HBsAg）,针对HBsAg的抗体可高效特异地与其结合。在现有的几种HBV基因治疗策略中,HBV核心蛋白显性负性突变体体外抑制病毒复制的效率最高。所以,本研究以HBV为研究对象,探索一条靶向抑制HBV复制的新途径,从而为已有的、及未来可能出现的难治性病毒性疾病探索一条新的治疗思路。方法利用分子克隆与DNA重组技术,构建在真核细胞内表达的重组质粒pPreS2-TLM-ScFv-EGFP;以限制性内切酶与DNA测序鉴定重组质粒；以转染级质粒抽提试剂盒对质粒进行抽提与纯化；用脂质体2000转染质粒至中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary cell, CHO）,以Zeocin筛选稳转细胞株；用荧光显微镜观察稳转细胞内融合蛋白PreS2-TLM-ScFv-EGFP的表达；用流式细胞仪测定表达PreS2-TLM-ScFv-EGFP融合蛋白的细胞阳性率；以Western blot检测细胞培养上清中的融合蛋白PreS2-TLM-ScFv-EGFP;以含有融合蛋白PreS2-TLM-ScFv-EGFP的上清分别孵育HepG2.2.15、HepG2与HeLa细胞,以Texas标记的抗GFP单克隆抗体通过免疫荧光染色检测融合蛋白PreS2-TLM-ScFv-EGFP在HepG2.2.15细胞内的定位；以激光共聚焦显微镜观察免疫荧光的染色结果；利用PCR与DNA重组技术构建HBc显性负性突变体HBcDN和重组质粒pPreS2-TLM-ScFv-HBcDN;以限制性内切酶与DNA测序鉴定重组质粒；用脂质体2000转染重组质粒pPreS2-TLM-ScFv-HBcDN入CHO细胞,以Zeocin和有限稀释法筛选表达融合蛋白PreS2-TLM-ScFv-HBcDN的稳定细胞株；以DNA与RNA抽提试剂盒提取并纯化稳转细胞内的总DNA与总RNA,分别作为PCR与RT-PCR的模板,以插入片段的特异性引物分别扩增HBcDN, PreS2-TLM-ScFv与PreS2-TLM-ScFv-HBcDN,用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物；用Western blot检测融合蛋白PreS2-TLM-ScFv-HBcDN的表达；收集含有融合蛋白PreS2-TLM-ScFv-HBcDN的细胞上清孵育HepG2.2.15细胞；参考文献报道方法提取HepG2.2.15细胞内病毒的核心颗粒,以RNA抽提试剂盒纯化核心颗粒内包装的HBV前体RNA,以相对定量RT-PCR的方法分析核心颗粒内包装的HBV前体RNA水平。结果用DNA序列比对软件EditSeq将阳性克隆质粒的测序结果与已知的序列进行比对分析显示编码融合蛋白PreS2-TLM-ScFv-EGFP的序列完全正确。荧光显微镜观察结果表明融合蛋白PreS2-TLM-ScFv-EGFP主要分布在稳转细胞的细胞质内。流式细胞仪测定结果显示稳定表达融合蛋白PreS2-TLM-ScFv-EGFP的细胞阳性率为83.47±6.05%。Western blot检测结果表明细胞培养上清中含有融合蛋白PreS2-TLM-ScFv-EGFP。激光共聚焦显微镜显示的免疫荧光结果表明Texas标记的抗GFP单克隆抗体在融合蛋白PreS2-TLM-ScFv-EGFP孵育过的HepG2.2.15细胞内有明显的染色且HepG2.2.15细胞内的总荧光强度明显高于HepG2、HeLa细胞内的总荧光强度。用DNA序列比对软件EditSeq将阳性克隆质粒的测序结果与已知的序列进行比对分析显示融合蛋白PreS2-TLM-ScFv-HBcDN的编码序列完全正确。稳定表达融合蛋白PreS2-TLM-ScFv-HBcDN的细胞命名为CHO-HBcDN,琼脂糖凝胶电泳结果显示分别以CHO-HBcDN细胞的总DNA与总RNA为模板的PCR与RT-PCR均获得了与插入片段大小对应的条带。Western blot结果表明在CHO-HBcDN细胞培养上清液中检测到融合蛋白PreS2-TLM-ScFv-HBcDN。定量RT-PCR结果的比较分析表明当HepG2.2.15细胞暴露于上清24、48与72h时,体积占培养基总体积25%的CHO-HBcDN上清,能够显着抑制HBV前体RNA的包装；当HepG2.2.15细胞暴露于上清72h时,12.5%的CHO-HBcDN上清也能够显着抑制HBV前体RNA的包装。结论本研究中,PreS2-TLM-ScFv-EGFP融合蛋白在CHO细胞内稳定表达后分泌到细胞培养上清；上清中的PreS2-TLM-ScFv-EGFP能够特异性地穿透至HepG2.2.15细胞的细胞质内；PreS2-TLM-ScFv-HBcDN融合蛋白在CHO细胞内稳定表达并分泌到细胞培养上清；上清中的PreS2-TLM-ScFv-HBcDN融合蛋白能够抑制HepG2.2.15细胞内乙肝病毒前体RNA在核心颗粒内的包装；细胞上清中含有的PreS2-TLM-ScFv-HBcDN融合蛋白对HepG2.2.15细胞内HBV复制的抑制作用与HepG2.2.15细胞暴露于上清的浓度和时间有关。25%的上清是抑制病毒复制的最佳浓度。
二、抗HBsAg单链抗体靶向干扰素的构建及原核表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、抗HBsAg单链抗体靶向干扰素的构建及原核表达（论文提纲范文）
（1）猪源抗猪腹泻重要病原体单链抗体及其保护作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 仔猪腹泻的防治研究进展 |
| 1.1 PEDV的防治研究进展 |
| 1.2 TGEV的防治研究进展 |
| 1.3 ETEC的防治研究进展 |
| 2 scFv及噬菌体展示技术 |
| 2.1 抗体简介 |
| 2.2 scFv的分子结构 |
| 2.3 scFv的表达 |
| 2.4 scFv的筛选方法 |
| 2.5 scFv的应用 |
| 3 壳聚糖纳米制剂药物口服递送系统概述 |
| 3.1 口服治疗与纳米技术 |
| 3.2 壳聚糖 |
| 3.3 壳聚糖的改性 |
| 3.4 壳聚糖纳米药物载体制备方法 |
| 3.5 壳聚糖纳米制剂在生物医学领域的应用 |
| 4 乳酸菌作为口服递送载体的研究进展 |
| 4.1 LAB |
| 4.2 LAB载体系统 |
| 4.3 NICE表达系统 |
| 4.4 LAB的表达形式 |
| 4.5 LAB表达系统的应用 |
| 5 研究目的与意义 |
| 第二章 猪源噬菌体-scFv库的构建和抗猪腹泻重要病原体scFv的筛选鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 质粒、细胞和菌株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要溶液 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 猪抗体水平检测 |
| 2.2 外周血淋巴细胞的分离 |
| 2.3 cDNA的合成 |
| 2.4 猪源scFv基因的扩增 |
| 2.5 猪源噬菌体-scFv库的构建 |
| 2.6 猪源噬菌体-scFv库的鉴定 |
| 2.7 PEDV和 TGEV全病毒抗原的制备 |
| 2.8 ETEC菌毛抗原的提取 |
| 2.9 M13KO7 辅助噬菌体的扩增 |
| 2.10 猪源噬菌体-scFv的富集筛选 |
| 2.11 噬菌体ELISA |
| 2.12 重组scFv蛋白的表达及纯化 |
| 2.13 免疫印迹 |
| 3 结果 |
| 3.1 猪抗体水平检测 |
| 3.2 scFv的获得 |
| 3.3 猪源噬菌体-scFv库的构建和鉴定 |
| 3.4 病毒的浓缩纯化 |
| 3.5 ETEC K88ac菌毛的纯化 |
| 3.6 猪源噬菌体-scFv的筛选鉴定 |
| 3.7 噬菌体ELISA鉴定 |
| 3.8 scFv的序列分析与纯化 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第三章 抗猪腹泻重要病原体scFv的生物学功能研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 质粒、细胞和毒株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要溶液 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 抗PEDV和 TGEV scFv的特性分析 |
| 2.2 真核表达质粒的构建 |
| 2.3 细胞转染 |
| 2.4 间接免疫荧光 |
| 2.5 细胞样品处理 |
| 2.6 病毒滴度的测定 |
| 2.7 scFv中和实验 |
| 2.8 scFv对 PEDV入侵Vero细胞的影响 |
| 2.9 抗K88ac菌毛多克隆抗体的制备 |
| 2.10 黏附实验和黏附抑制实验 |
| 2.11 IPEC-J2 细胞的细胞因子测定 |
| 2.12 ETEC感染小鼠腹泻模型的建立 |
| 2.13 抗k88ac scFv对感染ETEC小鼠的保护作用研究 |
| 2.14 小鼠细胞因子水平的检测 |
| 2.15 小鼠肠道病理切片制作及HE染色 |
| 2.16 小鼠肠道病理形态的定量分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 scFv的特异性实验 |
| 3.2 scFv的稳定性分析 |
| 3.3 scFv的亲和力分析 |
| 3.4 scFv的抗原结合位点分析 |
| 3.5 scFv的细胞毒性实验 |
| 3.6 scFv与病毒蛋白的结合 |
| 3.7 scFv的抗病毒作用分析 |
| 3.8 scFv对 PEDV入侵Vero细胞的影响 |
| 3.9 多克隆抗体ELISA效价检测 |
| 3.10 scFv对 ETEC黏附细胞的抑制作用分析 |
| 3.11 scFv对 ETEC诱导细胞因子表达的影响 |
| 3.12 小鼠腹泻模型的建立 |
| 3.13 scFv对小鼠腹泻的保护作用研究 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第四章 壳聚糖纳米口服scFv制剂及其生物学特性研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞和实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要溶液 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 CMCS纳米制剂的制备 |
| 2.2 表征分析 |
| 2.3 纳米制剂的包封率及载药量的测定 |
| 2.4 scFv在纳米制剂中的完整性 |
| 2.5 纳米制剂在模拟胃酸环境中的稳定性 |
| 2.6 scFv释放实验 |
| 2.7 纳米制剂的生物安全性实验 |
| 3 结果 |
| 3.1 CMCS的制备 |
| 3.2 纳米制剂的表征 |
| 3.3 载药率与包封率 |
| 3.4 scFv在纳米材料中的完整性 |
| 3.5 scFv在模拟胃酸环境中的稳定性 |
| 3.6 scFv的释放实验 |
| 3.7 纳米制剂的生物安全性 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第五章 scFv纳米口服制剂CMCS/CS-scFv对仔猪腹泻的保护作用研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株和实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要溶液 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 scFv的纯化制备 |
| 2.2 CMCS/CS-scFv和 scFv的口服鉴定 |
| 2.3 CMCS/CS-PZZ对仔猪感染PEDV的保护作用研究 |
| 2.4 CMCS/CS-TZZ对仔猪感染TGEV的保护作用研究 |
| 2.5 CMCS/CS-EZZ对仔猪感染ETEC的保护作用研究 |
| 2.6 scFv纳米制剂联合使用对仔猪感染腹泻病原的保护作用研究 |
| 3 结果 |
| 3.1 口服CMCS/CS-scFv和 scFv在肠道的分布 |
| 3.2 CMCS/CS-PZZ对仔猪感染PEDV的保护作用 |
| 3.3 CMCS/CS-TZZ对仔猪感染TGEV的保护作用 |
| 3.4 CMCS/CS-EZZ对仔猪感染ETEC的保护作用 |
| 3.5 纳米口服制剂CMCS/CS-scFv对腹泻病原体混合感染的保护作用 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第六章 分泌表达scFv的乳酸乳球菌制备及其保护功能研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株、细胞和实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要溶液 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 分泌表达scFv 的重组L.lactis-scFv 的构建 |
| 2.2 L.lactis电转化感受态细胞制备 |
| 2.3 L.lactis的电转化 |
| 2.4 重组L.lactis-scFv对模拟胃肠道环境的耐受性及生长曲线 |
| 2.5 重组L.lactis-scFv对 IPEC-J2 细胞的黏附 |
| 2.6 重组L.lactis-scFv对仔猪肠道的黏附 |
| 2.7 重组L.lactis-scFv的诱导表达 |
| 2.8 重组L.lactis-scFv分泌scFv的生物学功能分析 |
| 2.9 重组L.lactis-scFv分泌scFv的动物保护功能分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 scFv分泌表达载体的构建 |
| 3.2 重组L.lactis-scFv的生长特性 |
| 3.3 重组L.lactis-scFv的黏附特性 |
| 3.4 重组L.lactis-scFv分泌scFv的生物学功能鉴定 |
| 3.5 重组L.lactis-scFv的动物保护作用鉴定 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 全文总结 |
| 创新点 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一 常用溶液的配制 |
| 附录二 补充图 |
| 附录三 补充表 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 授权的发明专利 |
（2）靶向对虾白斑综合征病毒纳米给药系统研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 白斑病及白斑综合征病毒 |
| 1.1.1 WSD的症状和病理变化 |
| 1.1.2 WSSV的形态结构 |
| 1.1.3 WSSV的基因组结构 |
| 1.1.4 WSSV的病毒蛋白及其功能 |
| 1.1.5 WSD的防控 |
| 1.2 抗病毒药物概述 |
| 1.2.1 抗病毒药物的分类 |
| 1.2.2 抗病毒药物的作用机制 |
| 1.2.3 中草药在抗病毒药物开发中的应用 |
| 1.3 栀子及其活性成分的研究 |
| 1.3.1 栀子的化学成分研究 |
| 1.3.2 栀子及其活性成分的药理学研究 |
| 1.4 碳纳米管载药系统研究 |
| 1.4.1 CNTs作为小分子化合物呈递载体的研究 |
| 1.4.2 CNTs作为基因蛋白类药物呈递载体的研究 |
| 1.5 选题目的和意义 |
| 第二章 中草药抗WSSV活性筛选 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 动物与病毒 |
| 2.1.2 药物 |
| 2.1.3 试剂和仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 标准质粒p MD19T-VP28141 的构建 |
| 2.2.2 绝对荧光定量PCR标准曲线的构建 |
| 2.2.3 健康的克氏原螯虾挑选 |
| 2.2.4 WSSV攻毒浓度检测 |
| 2.2.5 克氏原螯虾体内WSSV的时空动态分析 |
| 2.2.6 中草药粗提物制备 |
| 2.2.7 中草药粗提物对克氏原螯虾的急性毒性 |
| 2.2.8 中草药粗提物在克氏原螯虾体内抗WSSV活性检测 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 绝对定量WSSV基因组DNA拷贝数方法的建立 |
| 2.3.2 WSSV致病性分析 |
| 2.3.3 克氏原螯虾不同组织中WSSV基因组DNA拷贝数的动态变化 |
| 2.3.4 克氏原螯虾鳃组织中WSSV基因表达水平的动态变化 |
| 2.3.5 中草药粗提物对克氏原螯虾的急性毒性 |
| 2.3.6 中草药粗提物在克氏原螯虾体内抗WSSV活性 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 栀子粗提物抗WSSV活性研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 动物与病毒 |
| 3.1.2 药物 |
| 3.1.3 试剂和仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 栀子粗提物在克氏原螯虾体内抗WSSV活性检测 |
| 3.2.2 栀子粗提物主要活性成分含量检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 栀子粗提物在克氏原螯虾体内抗WSSV活性 |
| 3.3.2 栀子粗提物主要活性成分含量检测 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 栀子3种活性成分抗WSSV活性研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 动物与病毒 |
| 4.1.2 药物 |
| 4.1.3 试剂和仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 GP、GPA和 GN对克氏原螯虾的安全性评价 |
| 4.2.2 GP、GPA和 GN在克氏原螯虾体内抗WSSV活性检测 |
| 4.2.3 GP、GPA和 GN在南美白对虾体内抗WSSV活性检测 |
| 4.2.4 GP和GPA的药代动力学研究 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 GP、GPA和 GN对克氏原螯虾的安全性评价 |
| 4.3.2 GP、GPA和 GN在克氏原螯虾体内抑制WSSV复制 |
| 4.3.3 GP、GPA和 GN提高感染WSSV克氏原螯虾的存活率 |
| 4.3.4 GP、GPA和 GN调控克氏原螯虾基因的表达 |
| 4.3.5 GP、GPA和 GN在南美白对虾体内抗WSSV活性 |
| 4.3.6 GP和GPA在克氏原螯虾体内的药代动力学研究 |
| 4.3.7 GP和GPA在南美白对虾体内的药代动力学研究 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 GP、GPA和 GN对 WSSV蛋白功能的作用研究 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 动物、细胞和病毒 |
| 5.1.2 药物 |
| 5.1.3 试剂和仪器 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 GP、GPA和 GN对 WSSV增殖的影响 |
| 5.2.2 p AC5.1-EGFP表达载体的构建及鉴定 |
| 5.2.3 WSSV囊膜蛋白真核表达载体的构建 |
| 5.2.4 GP、GPA和 GN对 WSSV囊膜蛋白在果蝇S2 细胞表达的影响 |
| 5.2.5 GP、GPA和 GN对 STAT基因转录的影响 |
| 5.2.6 GP、GPA和 GN与 WSSV囊膜蛋白分子对接模型预测 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 GP、GPA和 GN对 WSSV增殖的影响 |
| 5.3.2 WSSV囊膜蛋白真核表达载体的构建和鉴定 |
| 5.3.3 GP、GPA和 GN对 WSSV囊膜蛋白细胞内表达的影响 |
| 5.3.4 GP、GPA和 GN对 STAT基因转录的作用结果 |
| 5.3.5 GP、GPA和 GN与 WSSV囊膜蛋白的分子对接结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 靶向WSSV纳米给药系统构建及效果评价 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 细胞、动物与病毒 |
| 6.1.2 药物 |
| 6.1.3 仪器 |
| 6.1.4 试剂 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 p ET32a-P75E8 原核表达载体的构建 |
| 6.2.2 P75E8重组蛋白的表达与纯化 |
| 6.2.3 P75E8重组蛋白活性鉴定 |
| 6.2.4 p AC5.1-m Cherry真核表达载体的构建 |
| 6.2.5 p AC5.1-P75E8-m Cherry真核表达载体的构建 |
| 6.2.6 P75E8与VP28在果蝇S2细胞内的作用 |
| 6.2.7 P75E8与VP28互作位点研究 |
| 6.2.8 纳米给药系统的构建 |
| 6.2.9 纳米给药系统的表征 |
| 6.2.10 纳米给药系统在克氏原螯虾体内抗WSSV活性 |
| 6.2.11 纳米给药系统在克氏原螯虾体内的药代动力学 |
| 6.2.12 纳米给药系统在南美白对虾仔虾体内抗WSSV活性 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 单链抗体P75E8原核表达载体的构建和表达 |
| 6.3.2 P75E8重组蛋白活性鉴定 |
| 6.3.3 P75E8与VP28的相互作用 |
| 6.3.4 P75E8与VP28互作位点研究 |
| 6.3.5 纳米给药系统构建及表征 |
| 6.3.6 纳米给药系统在克氏原螯虾体内抑制WSSV复制 |
| 6.3.7 纳米给药系统提高感染WSSV克氏原螯虾的存活率 |
| 6.3.8 纳米给药系统在克氏原螯虾鳃组织中的代谢分析 |
| 6.3.9 纳米给药系统在南美白对虾仔虾体内抗WSSV活性 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（3）靶向乙型肝炎病毒核心蛋白定量检测方法的研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 乙型肝炎病毒核心蛋白在枯草芽孢杆菌中的分泌表达 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 靶向乙型肝炎病毒核心蛋白的单链抗体库的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 靶向乙型肝炎病毒核心蛋白的抗体对的筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间的研究成果及发表论文 |
（4）牛源抗金黄色葡萄球菌β溶血素单链抗体的筛选及保护作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 奶牛乳腺炎概述 |
| 1.1.1 发病现状及危害 |
| 1.1.2 奶牛乳腺炎的病原 |
| 1.1.3 金黄色葡萄球菌致病机制 |
| 1.1.4 防治进展 |
| 1.2 单链抗体研究进展 |
| 1.2.1 单链抗体简介 |
| 1.2.2 单链抗体的制备 |
| 1.2.3 单链抗体在金黄色葡萄球菌研究中的应用 |
| 1.3 本研究的目的和意义 |
| 第二章 金黄色葡萄球菌β溶血素(Hlb)原核表达抗原的制备 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌种和质粒 |
| 2.1.2 主要试剂和耗材 |
| 2.1.3 主要仪器和设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 Hlb基因的扩增 |
| 2.2.2 重组Hlb蛋白的诱导表达和可溶性鉴定 |
| 2.2.3 重组Hlb蛋白纯化和western-blot鉴定 |
| 2.2.4 重组Hlb蛋白溶血活性验证 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 PCR扩增hlb基因结果 |
| 2.3.2 重组质粒p ET32a-hlb的双酶切鉴定 |
| 2.3.3 重组Hlb蛋白的诱导表达和可溶性分析 |
| 2.3.4 重组Hlb蛋白的纯化和鉴定 |
| 2.3.5 重组Hlb蛋白溶血活性分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 牛源抗金葡菌β溶血素单链抗体的制备及初步鉴定 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 菌种和质粒 |
| 3.1.2 主要试剂和耗材 |
| 3.1.3 主要仪器和设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 牛源scfv噬菌体文库的富集筛选 |
| 3.2.2 富集的噬菌体文库中抗β溶血素scfv的噬菌体ELISA鉴定 |
| 3.2.3 单链抗体的原核表达和纯化 |
| 3.2.4 抗β溶血素scfv溶血活性抑制实验 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 牛源噬菌体文库的富集筛选 |
| 3.3.2 针对β溶血素单链抗体的噬菌体ELISA鉴定 |
| 3.3.3 抗β溶血素scfv的原核表达和可溶性鉴定 |
| 3.3.4 抗β溶血素scfv溶血活性抑制实验 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 牛源抗金葡菌β溶血素单链抗体对小鼠乳腺的保护作用研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 主要试剂和耗材 |
| 4.1.3 主要仪器和设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 菌液制备 |
| 4.2.2 实验动物的分组和处理 |
| 4.2.3 乳腺组织外观和病理学观察 |
| 4.2.4 乳腺组织细菌计数 |
| 4.2.5 乳腺组织切片免疫组化 |
| 4.2.6 乳腺组织细胞因子测定 |
| 4.2.7 数据处理 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 乳腺组织的细菌计数 |
| 4.3.2 乳腺组织HE染色 |
| 4.3.3 乳腺组织免疫组化 |
| 4.3.4 乳腺组织细胞因子含量测定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间已发表或录用的论文 |
（5）猪圆环病毒2型Cap蛋白与重组单链抗体APCH1的融合表达及其免疫原性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表(Abbreviation) |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 猪圆环病毒2型的分子生物学特性 |
| 1.1.1 猪圆环病毒2型的病原特征 |
| 1.1.2 PCV2基因组结构及编码蛋白 |
| 1.1.3 PCV2免疫原性蛋白的结构特点 |
| 1.1.4 猪圆环病毒2型致病机理 |
| 1.2 猪圆环病毒疫苗的研究进展 |
| 1.2.1 全病毒灭活疫苗 |
| 1.2.2 亚单位基因工程疫苗 |
| 1.2.3 重组活载体疫苗 |
| 1.2.4 核酸疫苗 |
| 1.3 分子佐剂 |
| 1.4 杆状病毒表达系统 |
| 第二章 研究目的与意义 |
| 第三章 材料与方法 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 病毒、细胞和菌株 |
| 3.1.2 载体、质粒和引物 |
| 3.1.3 工具酶及主要试剂 |
| 3.1.4 免疫反应试验所用抗原及血清 |
| 3.1.5 培养基与抗生素及其配制 |
| 3.1.6 主要缓冲液与相关试剂及其配制 |
| 3.1.7 其它缓冲液及试剂 |
| 3.1.8 实验动物 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 PCV2的增殖 |
| 3.2.2 限制性内切酶酶切反应 |
| 3.2.3 PCR产物或酶切产物的电泳检测 |
| 3.2.4 酶切产物回收与纯化 |
| 3.2.5 外源DNA片段与质粒载体的连接反应 |
| 3.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 3.2.7 连接产物的转化 |
| 3.2.8 质粒的制备与鉴定 |
| 3.2.9 质粒DNA浓度的测定 |
| 3.2.10 重组Bacmid DNA的提取 |
| 3.2.11 重组杆状病毒的制备 |
| 3.2.12 Western blot试验 |
| 3.2.13 间接免疫荧光试验(IFA) |
| 3.2.14 微量中和试验 |
| 3.2.15 间接ELISA |
| 3.2.16 饲养细胞的准备 |
| 3.2.17 骨髓瘤细胞的复苏活化及融合用骨髓瘤细胞的制备 |
| 3.2.18 细胞融合 |
| 3.2.19 阳性细胞孔的筛选 |
| 3.2.20 阳性细胞的克隆 |
| 3.2.21 单克隆抗体的大量制备 |
| 3.2.22 抗体的纯化 |
| 3.2.23 过碘酸钠氧化法制备HRP标记的单抗 |
| 3.2.24 细胞免疫的检测 |
| 3.2.25 小鼠的免疫与攻毒保护性试验 |
| 3.2.26 组织病理变化分析 |
| 3.2.27 统计学方法 |
| 第四章 结果与分析 |
| 4.1 重组杆状病毒rBV-APCH1-Cap的构建及融合蛋白的表达 |
| 4.1.1 重组质粒pFastBac Dual-APCH1-△41ORF2的构建 |
| 4.1.2 重组质粒pFastBac Dual-D-APCH1-△41ORF2的构建 |
| 4.1.3 穿梭质粒Bacmid-APCH1-△41ORF2的构建 |
| 4.1.4 重组杆状病毒rBV-APCH1-Cap的制备 |
| 4.1.5 重组杆状病毒rBV-APCH1-Cap的纯化与滴度测定 |
| 4.1.6 间接免疫荧光试验(IFA)检测重组蛋白的表达 |
| 4.1.7 Western blot检测重组蛋白的表达 |
| 4.2 猪圆环病毒2型Cap蛋白定量检测方法的建立 |
| 4.2.1 重组转移质粒pFastBacDual-D-GP64SP-△ORF2-His的构建 |
| 4.2.2 重组杆状病毒rBV-D-Cap-His目的蛋白的表达 |
| 4.2.3 抗原标准品的纯化 |
| 4.2.4 PCV2Cap蛋白单克隆抗体的制备及相关特性检测 |
| 4.2.5 双抗夹心ELISA定量检测Cap蛋白方法的建立 |
| 4.2.6 重组目的蛋白APCH1-Cap和Cap的制备及定量 |
| 4.3 重组亚单位疫苗APCH1-Cap在小鼠体内诱发的免疫保护 |
| 4.3.1 免疫小鼠的ELISA抗体水平 |
| 4.3.2 免疫小鼠的中和抗体水平 |
| 4.3.3 免疫小鼠淋巴细胞增殖检测 |
| 4.3.4 免疫小鼠淋巴细胞增殖的FCM检测分析 |
| 4.3.5 免疫小鼠脾细胞分泌的细胞因子水平分析 |
| 4.3.6 实时荧光定量PCR检测免疫小鼠脾细胞中IFN-γmRNA表达 |
| 4.3.7 攻毒后小鼠的组织病理变化 |
| 第五章 讨论与结论 |
| 5.1 讨论 |
| 5.1.1 双抗夹心ELISA定量检测免疫原性蛋白 |
| 5.1.2 APCH1分子佐剂诱导体液免疫和细胞免疫的可能机制 |
| 5.1.3 重组亚单位疫苗APCH1-Cap在小鼠体内诱导的保护性免疫 |
| 5.2 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（6）基于南瓜蛋白和曲妥珠单抗的免疫毒素的制备及抗肿瘤作用研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 T-CUS_(245C)的制备及体外抗肿瘤活性检测 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验细菌 |
| 1.2 实验细胞 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器和设备 |
| 1.5 主要实验试剂配制方法 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 流式细胞学检测各细胞株HER-2表达情况 |
| 2.2 CUS_(245C)的制备与纯化 |
| 2.2.1 重组质粒的构建 |
| 2.2.2 重组质粒的转化 |
| 2.2.3 CUS_(245C)的表达与纯化 |
| 2.3 免疫毒素T-CUS_(245C)的制备 |
| 2.3.1 免疫毒素T-CUS_(245C)的偶联 |
| 2.3.2 免疫毒素T-CUS_(245C)的纯化 |
| 2.3.3 免疫毒素T-CUS_(245C)的鉴定 |
| 2.4 T-CUS_(245C)的体外抗肿瘤活性 |
| 2.4.1 细胞培养 |
| 2.4.2 SRB检测免疫毒素T-CUS_(245C)的体外抗肿瘤活性 |
| 2.5 数据处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 各细胞株HER-2 表达情况 |
| 3.2 CUS_(245C)的原核表达与纯化 |
| 3.3 T-CUS_(245C)的制备与检测 |
| 3.3.1 T-CUS_(245C)的偶联与纯化 |
| 3.3.2 免疫毒素T-CUS_(245C)的鉴定 |
| 3.3.3 T-CUS_(245C)诱导细胞凋亡的检测 |
| 3.4 T-CUS_(245C)的体外抗肿瘤活性 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二部分 T-CUS_(245C)的内化作用及其与药效的关系 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器和设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 南瓜蛋白单克隆抗体的制备 |
| 2.1.1 杂交瘤细胞的体外培养 |
| 2.1.2 Protein G亲和层析法纯化南瓜蛋白单克隆抗体 |
| 2.1.3 南瓜蛋白单克隆抗体的鉴定 |
| 2.2 T-CUS_(245C)内化作用的检测 |
| 2.2.1 鼠抗CUS_(245C)单克隆抗体FITC荧光标记 |
| 2.2.2 细胞爬片 |
| 2.2.3 药物处理 |
| 2.2.4 细胞破膜固定 |
| 2.2.5 染色 |
| 2.2.6 封片 |
| 2.2.7 激光共聚焦显微镜上机成像 |
| 2.3 T-CUS_(245C)内化强度改变对细胞毒作用的关系检测 |
| 2.3.1 普萘洛尔增强T-CUS_(245C)内化作用的检测 |
| 2.3.2 普萘洛尔和洛利普兰对SK-OV-3的生长抑制作用-- |
| 2.3.3 普萘洛尔和洛利普兰对T-CUS_(245C)药效的影响 |
| 2.4 公式计算和统计 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 抗CUS_(245C)单克隆抗体(1G9)的制备与纯化 |
| 3.2 T-CUS_(245C)的内化作用及溶酶体共定位 |
| 3.3 T-CUS_(245C)内化作用与其药效的关系 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 Ts/CUS的制备及抗肿瘤活性研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验细菌 |
| 1.2 实验细胞 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器和设备 |
| 1.5 主要试剂配置方法 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 pET-32a(+)Ts/CUS基因构建 |
| 2.1.1 Ts/CUS的 PCR引物设计 |
| 2.1.2 Ts基因扩增 |
| 2.1.3 CUS基因扩增 |
| 2.1.4 PCR产物切胶回收纯化 |
| 2.1.5 制备线性粘性末端pET-32a(+)载体 |
| 2.1.6 连接反应 |
| 2.1.7 连接产物的转化 |
| 2.1.8 重组载体pET-32a-Ts/CUS的挑取 |
| 2.2 Ts表达纯化产物的鉴定 |
| 2.2.1 流式细胞技术检测Ts抗原结合特异性 |
| 2.2.2 Ts亲和力测定 |
| 2.3 重组质粒pET-32a-Ts/CUS的鉴定 |
| 2.4 重组蛋白Ts/CUS的诱导表达与纯化 |
| 2.4.1 Ts/CUS的表达 |
| 2.4.2 Ts/CUS的纯化 |
| 2.5 重组蛋白的鉴定 |
| 2.5.1 SDS-PAGE鉴定 |
| 2.5.2 Western blot免疫印记试验 |
| 2.5.3 Ts/CUS诱导细胞凋亡检测 |
| 2.6 重组免疫毒素Ts/CUS的结合活性检测 |
| 2.7 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 单链抗体Ts基因的构建、表达纯化及鉴定 |
| 3.2 pET-32a-Ts/CUS质粒的构建和鉴定 |
| 3.3 融合免疫毒素Ts/CUS的表达、纯化与鉴定 |
| 3.4 Ts/CUS对SK-OV-3细胞的凋亡诱导作用 |
| 3.6 SRB检测Ts/CUS的体外增殖抑制作用 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第四部分 Ts/CUS联合Keytruda在对肿瘤细胞的杀伤作用 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器和设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 流式细胞学检测各细胞株PD-L1表达情况 |
| 2.2 人淋巴细胞提取与分离 |
| 2.3 抗体阻断实验 |
| 2.4 肿瘤细胞淋巴细胞共培养 |
| 2.5 ELISA检测上清IL-2和IFN-γ |
| 2.6 流式细胞学检测肿瘤细胞调往和淋巴细胞亚型 |
| 2.7 数据处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 各细胞株PD-L1表达情况的检测及抗PD-1抗体的选择 |
| 3.2 Ts/CUS联合Keytruda共培养系统中抗肿瘤作用 |
| 3.3 Ts/CUS联合Keytruda对T淋巴细胞亚型的影响 |
| 3.4 Ts/CUS联合Keytruda对培养上清IFN-γ的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（7）基于FnBPA和CD11c单链抗体的侵入型乳酸菌构建及其分子免疫机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 猪流感的研究进展 |
| 1.1 猪流感的流行现状 |
| 1.2 猪流感病毒的结构特点 |
| 1.3 猪流感病毒疫苗的研究进展 |
| 第二章 侵入型乳酸菌载体的研究进展 |
| 2.1 乳酸菌作为口服递送载体的研究进展 |
| 2.2 基于Fn BPA的侵入型乳酸菌的研究进展 |
| 2.3 DCs靶向型疫苗的研究进展 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 基于FnBPA的侵入型乳酸菌的构建及免疫调节作用 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 表达CD11c单链抗体的侵入型乳酸菌的构建及免疫调节作用 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 两类侵入型乳酸菌递送SIV HA蛋白的免疫保护效果评价 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 表达CD11c单链抗体侵入型乳酸菌的分子免疫机制研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 英文缩写词表 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（8）治疗视神经脊髓炎全人源抗C5单链抗体的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、对象和方法 |
| 1.1 试剂及配制 |
| 1.2 制备scFv抗体库的甘油原液 |
| 1.3 辅助性噬菌体的制备 |
| 1.3.1 辅助性噬菌体的扩增 |
| 1.3.2 辅助性噬菌体滴度的测定 |
| 1.4 噬菌体抗体的筛选及验证 |
| 1.4.1 噬菌体抗体库的筛选 |
| 1.4.2 噬菌体ELISA |
| 1.4.3 测序 |
| 1.5 原核表达载体的构建(以C5B3 进行说明) |
| 1.5.1 目的片段和载体的处理 |
| 1.5.2 连接 |
| 1.5.3 转化 |
| 1.5.4 测序及序列比对 |
| 1.6 可溶性单链抗体的表达 |
| 1.6.1 单链抗体诱导表达 |
| 1.6.2 表达条件的优化 |
| 1.6.3 可溶性分析 |
| 1.7 可溶性单链抗体的纯化(以C5B3 为例进行说明) |
| 1.7.1 菌体的诱导 |
| 1.7.2 亲和层析纯化C5-单链抗体 |
| 1.7.3 DEAE层析纯化C5-单链抗体 |
| 1.7.4 Butyl层析纯化C5-单链抗体 |
| 1.7.5 C5-单链抗体的透析和浓缩 |
| 1.7.6 蛋白浓度的测定 |
| 1.8 可溶性C5-单链抗体ELISA检测 |
| 1.9 免疫斑点实验 |
| 1.10 SDS-PAGE凝胶电泳 |
| 1.11 考马斯亮蓝染色 |
| 1.12 Western Blot实验 |
| 1.13 表面等离子体共振 |
| 1.14 NMO病人的选择 |
| 1.15 NMO患者抗体的分离提纯 |
| 1.16 M23-AQP4 慢病毒的包装、滴度的测定及感染 |
| 1.17 细胞复苏培养和传代冻存 |
| 1.18 小鼠NMOSD动物模型的诱导 |
| 1.18.1 实验动物的分组及饲养 |
| 1.18.2 NMO动物模型的诱导 |
| 1.19 补体依赖性细胞毒性 |
| 1.20 细胞荧光染色 |
| 1.21 冰冻组织切片免疫组化 |
| 1.21.1 冰冻组织切片的制作 |
| 1.21.2 免疫荧光染色 |
| 1.22 统计分析 |
| 二、实验结果 |
| 2.1 通过噬菌体展示筛选补体C5 结合的噬菌体抗体 |
| 2.2 构建同源性较高的抗体序列至原核表达载体 |
| 2.3 原核表达载体pET30a-C5B3 转染入BL21 表达可溶性C5-单链抗体 |
| 2.4 经过纯化得到纯度较高的可溶性的单链抗体 |
| 2.5 可溶性抗补体C5-单链抗体与补体C5 特异性结合 |
| 2.6 单链抗体C5B3 与补体C5 的浓度依赖性结合和亲和力 |
| 2.7 C5B3 能对AQP4-IgG和补体造成的细胞损害起到保护作用 |
| 2.8 C5B3对AQP4-IgG和补体造成细胞毒性的保护作用具有浓度依赖性 |
| 2.9 C5B3 阻断NMO发病过程中的补体途径 |
| 2.10 C5B3 不影响AQP4-IgG与 AQP4 的结合 |
| 2.11 C5B3 减少NMO体外模型中膜攻击复合物的形成 |
| 2.12 阻断抗体减少体内小鼠模型中的NMO损伤 |
| 2.13 C5B3 能够减少NMO小鼠模型脑实质炎症细胞的浸润 |
| 三、讨论 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）肝靶向干扰素的研究进展（论文提纲范文）
| 1 脂质体干扰素 |
| 2 糖基化肝靶向干扰素 |
| 3 与HBs Ab交联干扰素 |
| 4 其他 |
| 4.1 肝靶向肽干扰素 |
| 4.2 人血清白蛋白干扰素 |
| 4.3 由血红细胞运载的干扰素 |
| 5 结语 |
（10）显性负性突变体融合蛋白PreS2-TLM-ScFv-HBcDN抑制乙肝病毒复制的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词简表 |
| 目录 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述一 |
| 参考文献 |
| 综述二 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文 |
| 会议摘要 |
| 在读期间参与的课题研究 |
| 在读期间的主要获奖情况 |
四、抗HBsAg单链抗体靶向干扰素的构建及原核表达（论文参考文献）
- [1]猪源抗猪腹泻重要病原体单链抗体及其保护作用研究[D]. 张凡庆. 上海交通大学, 2020(01)
- [2]靶向对虾白斑综合征病毒纳米给药系统研究[D]. 黄爱国. 西北农林科技大学, 2020(02)
- [3]靶向乙型肝炎病毒核心蛋白定量检测方法的研究[D]. 平芳. 重庆医科大学, 2020(12)
- [4]牛源抗金黄色葡萄球菌β溶血素单链抗体的筛选及保护作用研究[D]. 管玉. 上海交通大学, 2020(01)
- [5]猪圆环病毒2型Cap蛋白与重组单链抗体APCH1的融合表达及其免疫原性研究[D]. 刘丽枝. 华中农业大学, 2019(02)
- [6]基于南瓜蛋白和曲妥珠单抗的免疫毒素的制备及抗肿瘤作用研究[D]. 熊佳妮. 福建医科大学, 2019(07)
- [7]基于FnBPA和CD11c单链抗体的侵入型乳酸菌构建及其分子免疫机制研究[D]. 刘晶. 吉林农业大学, 2019
- [8]治疗视神经脊髓炎全人源抗C5单链抗体的研究[D]. 朱文莉. 天津医科大学, 2019(02)
- [9]肝靶向干扰素的研究进展[J]. 王玉娇,卢雪梅,金小宝,朱家勇. 广东药学院学报, 2015(03)
- [10]显性负性突变体融合蛋白PreS2-TLM-ScFv-HBcDN抑制乙肝病毒复制的研究[D]. 刘伟侠. 浙江大学, 2012(09)