一、人卵巢颗粒细胞雌激素β型受体cDNA的克隆和序列分析（论文文献综述）
汪稳[1]（2017）在《ERK信号通路相关基因在番鸭不同时期卵巢中的作用研究》文中进行了进一步梳理番鸭的就巢一直是困扰养殖行业的重要问题,虽然已有学者对番鸭的就巢性进行过研究报道,但更多局限于某一基因对特定发育阶段和部位所起的作用。为了探究ERK信号通路相关基因在番鸭就巢调控中的作用,本试验利用SMART-RACE技术和生物信息学方法研究了细胞外信号调节激酶2（ERK2）和生长因子受体结合蛋白2（GRB2）的基因特征;同时采用qRT-PCR技术对番鸭不同组织不同时期ERK信号通路中的相关基因进行了表达谱分析;并结合Cytoscape软件构建了这些基因在不同时期下的相互作用网络调控模式图。结果如下:1.番鸭ERK2的cDNA序列全长3037bp,包括5’非编码区194bp、3’非编码区1736bp和ORF区1107bp,其中ORF区能够编码368个氨基酸。预测其相对分子质量为41.9kDa,等电点6.36;二级结构编码的蛋白含35.05%的α螺旋、8.97%的β折叠和55.98%的无规则卷曲,属于一种亲水性稳定蛋白,不存在信号肽和跨膜结构。同源比对发现该基因与绿头鸭、鸿雁的mRNA同源性较高,进化分析表明其与绿头鸭的亲缘关系最近。qRT-PCR结果显示,ERK2基因在番鸭卵巢、下丘脑中的表达量极显着高于其他各组织器官（P<0.01）。在不同时期（青年期、产蛋期、就巢期）的性腺轴中,ERK2基因都是在卵巢上表达量最高,且差异极显着（P<0.01）;在下丘脑和垂体上的差异性规律与卵巢相似,产蛋期高于青年期和就巢期,差异显着（P<0.05）。2.番鸭GRB2基因全长3528bp,它包括5’非编码区47bp,3’非编码区2827bp和ORF区654bp,其中ORF区可以编码217个氨基酸。预测其相对分子质量为25.2 kDa,等电点5.78;蛋白结构预测显示,GRB2蛋白包含SH3-SH2-SH3三个功能域,是一种亲水性稳定蛋白,不存在信号肽和跨膜结构;同源比对发现该基因与绿头鸭的mRNA的同源性较高,进化分析表明其与吐绶鸡的亲缘关系最近。qRT-PCR结果表明,GRB2基因在卵巢中的表达量极显着高于其他组织（P<0.01）;在产蛋期卵巢上表达量最高,三个不同的生长时期之间差异显着（P<0.05）;在下丘脑上的表达量从青年期到就巢期先升高后降低;而在垂体上的表达量从青年期到就巢期一直递减,差异显着（P<0.05）。3.从转录组EST数据库中筛选获得了其它20个ERK信号通路相关基因,检测到这些基因在不同时期番鸭的卵巢中,都有不同程度上的变化。结果表明,Mek2、Rap16、MRAS、Elk1、PLCB1、SRF、Raf1、Mos、Pak1、Crebl2、SOS1、SOS2、RASA2、ERK2、GRB2 等15个基因在番鸭23周龄、36周龄、50周龄的卵巢组织中表达存在显着差异（p<0.05）,DUSP4、MAP2K1、MYC、PRKACB、GPR39、RPS6KA3、Mknk1等7个基因在番鸭不同时期的卵巢中稳定表达。其中GRB2、ERK2、SRF、SOS1、PLCB1、RASA2在产蛋期卵巢中的表达量高于青年期和就巢期。利用Cluster软件对这些基因在不同时期的表达情况进行了分层聚类分析,结果表明同一基因在不同时期的卵巢中有着不同程度的差异性,不同基因在同一时期也启动了不同的基因表达模式。4.以产蛋期基因的表达为参照,用Cytoscape软件构建青年期和就巢期番鸭卵巢的网络调控模式图。结果显示,Elk1基因在青年期中出现了明显的上调,MYC、RASA2、SOS1、SOS2、MRAS、PLCB1基因出现了明显的下调,提示这些基因可能在番鸭卵巢生长发育过程中具有重要作用;Rap16、MRAS、Mek2、Raf1和Mos基因在就巢期中出现了明显的上调,GRB2、ERK2和SRF基因出现了明显下调,表明这些基因可能在番鸭就巢过程中发挥着调控作用。以上两个时期的网络调控模式图在一定程度上揭示了 ERK信号通路相关基因对番鸭卵巢发育和就巢产生的不同影响。
刘海港[2]（2013）在《济宁青山羊和沂蒙黑山羊ERα和ERβ全基因克隆与多克隆抗体的制备及应用研究》文中研究表明济宁青山羊是我国重要的山羊品种资源，具有性成熟早，繁殖率高，四季发情，遗传性稳定，适应性强，肉质鲜美等优良的种质特性，是独特的羔皮品种；沂蒙黑山羊是山东省地方优良肉用品种，但性成熟相对较晚，繁殖率相对较低；二者繁殖性状具有明显的差异。有关两种山羊性成熟、繁殖率、多胎性等生物学特性的遗传差异机制是多年来国内外研究学者关注的科学问题，是否与雌激素受体的表达、分布及其功能存在内在的联系目前尚不完全清楚。但目前有关济宁青山羊和沂蒙黑山羊两种亚型的雌激素受体（ERα/β）基因克隆尚未见报道，另外，由于缺乏对它们进行特异性结合的抗体，也限制了对雌激素受体分布、表达及其功能的研究。本研究旨在克隆济宁青山羊和沂蒙黑山羊雌激素受体基因，分析基因结构和功能特性，进行原核表达，制备多克隆抗体，建立免疫组化分析方法，检测山羊卵巢和子宫内ERs的分布。根据GenBank发布的绵羊ERα和ERβ基因序列设计引物，应用RT-PCR方法从济宁青山羊和沂蒙黑山羊卵巢组织中扩增ERα和ERβ基因。经双酶切和测序分析后，连接到原核表达载体pET32a（+），构建重组表达载体pET32a（+）-ERα和pET32a（+）-ERβ，转化至大肠杆菌BL21（DE3）中，经IPTG诱导，表达产物经SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定；经Ni-NTA纯化融合蛋白后免疫新西兰大白兔，制备多克隆抗体，并检测抗体效价及特异性；使用该抗体检测济宁青山羊和沂蒙黑山羊卵巢和子宫组织细胞中的ERα和ERβ的分布。实验结果显示：1．克隆出济宁青山羊和沂蒙黑山羊ERα和ERβ基因的全部开放阅读框，长度分别为1791bp和1584bp。分析与其它物种同源性并构建基因进化树，显示雌激素受体基因在物种进化过程中呈现了高度的保守性，比较了两种山羊雌激素受体氨基酸序列及蛋白空间结构差异，ERβ的变异程度较ERα更大。2．成功构建原核表达载体pET32a（+）-ERα和pET32a（+）-ERβ，重组载体可在BL21（DE3）宿主菌中进行高效表达，表达出分子量约为45ku和53ku的融合蛋白；Western blotting证明两种融合蛋白能均能与兔抗人的ERs多克隆抗体特异性反应，制备的多克隆抗体经ELISA检测效价均达到1:214以上，以此抗体代替购置的标准兔抗人ERs抗体，进行Western blotting反应，特异性良好。3．建立了可靠的检测两种亚型雌激素受体分布的免疫组化方法，对济宁青山羊和沂蒙黑山羊卵巢、子宫等组织检测结果表明，ERα和ERβ在济宁青山羊和沂蒙黑山羊卵巢和子宫的分布情况大致相同。在卵巢成熟卵泡膜细胞、上皮细胞和颗粒细胞以及子宫内膜上皮细胞、腺上皮细胞、平滑肌细胞存在ERα大量分布，而ERβ主要分布于卵巢颗粒细胞和子宫内膜上皮细胞、平滑肌细胞。本研究克隆了济宁青山羊和沂蒙黑山羊ERα和ERβ基因；获得了特异性兔抗山羊ERs多克隆抗体，使用该抗体建立免疫组化方法检测了济宁青山羊和沂蒙黑山羊卵巢及子宫ERs的分布表达，为进一步研究雌激素受体的生物学功能奠定了方法学和形态学基础。
胡俊杰[3]（2012）在《双峰驼繁殖季节生殖轴系中褪黑素受体分布及信号转导》文中研究说明温热带哺乳动物繁殖活动有季节性特点。褪黑素是主要由哺乳动物松果腺分泌的一种激素，被认为是调节哺乳动物季节性繁殖的主要影响因子，并通过哺乳动物生殖轴系中分布的褪黑素受体调控动物的生殖。双峰驼是生活在温热带季节性繁殖动物，然而褪黑素受体在双峰驼生殖轴系中的表达和分布特征及调控机理还不清楚。本研究选择繁殖季节（1112月份）的雌性双峰驼为对象，采用分子生物学、免疫组化、原位杂交、酶联免疫吸附法和细胞培养方法，研究双峰驼生殖轴系褪黑素受体的分布及信号转导，旨在揭示褪黑素与双峰驼的生殖，特别是双峰驼季节性繁殖的关系，以期探讨褪黑素调控动物季节性繁殖的机理，同时也可为研究动物整个生殖活动的调节机理提供新的思路。应用RT-PCR方法从双峰驼松果体及生殖轴系中成功克隆了褪黑素受体MT1（452bp）和MT2（411bp）部分基因，通过在GenBank中查序比对，发现MT1与牛的最为相似（87.5%），MT2与猪的最为相似（91.3%）；对其编码的蛋白进行结构预测和比对，双峰驼MT1和MT2受体是属于G蛋白偶联受体家族的蛋白，双峰驼的MT1和MT2基因为首次报道。原位杂交结果显示MT1和MT2mRNA在下丘脑、垂体和卵巢组织中均有弥散性分布，在白体、初级卵泡卵原细胞和生长卵泡卵母细胞内阳性强于其他区域，分布于胞浆和胞核内。免疫组织化学结果显示MT1和MT2受体在松果体和生殖轴系组织中均表达，但有一定的组织和细胞表达位置的差异性，说明在Mel调节不同的组织器官的生理功能上，MT1和MT2受体既有协同作用也有各自独立性。Western blot实验显示卵巢中分布的MR高于下丘脑、垂体和松果体，这可能是卵巢黄体和白体中褪黑素受体高表达而引起的。成功培养了双峰驼垂体腺细胞和卵巢颗粒细胞，两种细胞都能传代培养，褪黑素可改变卵巢颗粒细胞和垂体细胞内cAMP的累积，说明褪黑素对卵巢颗粒细胞的调控与百日咳毒素敏感的G蛋白依赖的Gi和Gs通路有关，而褪黑素对细胞内cGMP的累积值也有影响，且与cAMP的影响不同，说明褪黑素还通过其他信号转导通路调控细胞。应用实时荧光定量PCR方法研究表褪黑素对双峰驼卵巢颗粒细胞MT1和MT2mRNA的表达有时效关系和浓度依赖性。高浓度的褪黑素（10nmol/mL）可显着的促进MR mRNA的表达。用褪黑素处理1h后mRNA的表达量最高，而且MT1mRNA的表达量高于MT2。通过本研究首次报道了双峰驼的MT1和MT2基因，探索了MT1和MT2受体在繁殖季节的双峰驼生殖轴系和松果体中广泛表达和分布特点及信号转导通路，尤其是研究表明褪黑素对其受体的表达具有促进作用，这为褪黑素调控动物季节性繁殖及褪黑素的作用机理研究提供了新思路。
张宝乐[4]（2012）在《猪Gpr3基因特征、表达及其对卵泡颗粒细胞的影响》文中认为哺乳动物卵泡发育是一个复杂的生理生化过程,主要包括：原始卵泡的募集、腔前卵泡的发育、有腔卵泡的选择和生长及卵泡的成熟或闭锁。该过程受激素、生长因子、金属离子等多种因素控制,最终只有少数卵泡发育为优势卵泡并排卵,99%以上的卵泡发生闭锁。卵泡颗粒细胞是卵泡中最重要的体细胞,它对卵母细胞成熟、卵泡发育有至关重要的作用。伴随着哺乳动物卵泡生长和发育,颗粒细胞体积增大、数量增多并逐步分化和成熟。G蛋白偶联受体3（G protein-coupled receptor3, Gpr3）属于G蛋白偶联受体超家族成员。近年来的研究表明,Gpr3在小鼠和人的卵巢中通过Gs蛋白介导的下游通路调节卵泡的生长发育和卵母细胞的成熟。但Gpr3在猪卵巢中的表达规律及在卵泡颗粒细胞中的作用目前尚未见报道。因此,深入研究猪Gpr3在卵巢及卵泡发育过程中的表达规律,探索Gpr3信号通路在卵泡颗粒细胞中的作用及其调控机制,可以为哺乳动物繁殖性状的选育提供可能的理论基础,在提高家畜繁殖性能方面具有重要意义。本论文以三元商品猪为研究对象,采用电子克隆与传统克隆相结合的方法,利用RT-PCR和RACE技术,获得了猪Gpr3基因的全长序列和含有完整编码框的Gpr6及Gprl2的部分cDNA序列,并利用生物信息学方法对其结构及功能进行了系统的研究；利用实时荧光定量（real-time） PCR和免疫蛋白印迹（Western blotting）技术对Gpr3在组织及卵母细胞体外成熟过程中的表达规律进行了分析；利用免疫组织化学方法对猪胎儿期50、70和90（日龄）、新生1日龄及生后期25、35、70、140和180（日龄）9个阶段猪卵巢组织中Gpr3蛋白的表达进行了细胞定位；利用real-time PCR和Western blotting技术对不同日龄、不同品种卵巢及不同直径卵泡中Gpr3的表达规律进行了分析；利用构建的Gpr3真核表达载体及与GFP融合表达载体检测了Gpr3在人胚肾（HEK293）细胞中的亚细胞定位、组成性活性以及鞘脂类脂质对Gpr3组成性活性和受体内化作用的影响；采用RNAi技术敲减Gpr3,阻抑Gpr3介导的信号通路,利用MTT、流式细胞术、放射免疫测定（Radioimmunoassay, RIA）、real-time PCR等方法检测阻抑该信号通路对猪卵泡颗粒细胞的作用及其分子机制；采用超表达Gpr3的方式激活其介导的信号通路,利用MTT、流式细胞术、RIA、real-time PCR等方法检测超表达Gpr3后对猪卵泡颗粒细胞生长及分化的影响,主要研究结果如下：1用电子克隆和RACE的方法克隆了猪Gpr3基因的全长序列和含有完整编码框的Gpr6及Gpr12的部分cDNA序列,GenBank登录号分别为HQ606483、HM777010和HM77711,并做生物信息学预测分析,结果表明：猪Gpr3基因的cDNA由2101个核苷酸组成,编码330个氨基酸,分子量为35.2kDa,位于第6号染色体,与牛、犬、人、黑猩猩、小鼠和大鼠的氨基酸相似性分别为96.4%,95.1%,94.9%,94.8%,90.0%和85.4%。它具有典型的七次跨膜结构域,存在多个潜在的磷酸化和糖基化修饰位点,表明它是一个功能活跃的跨膜蛋白,可能参与信号传导、细胞生长调控等过程。另外,猪Gpr3、Gpr6和Gpr12的蛋白序列比对及功能预测分析发现,它们彼此间具有高度的序列同源性和相似的潜在功能,将三者归为同一受体亚家族,称为Gpr3亚家族。2用real-time PCR和Western blotting的方法检测猪Gpr3基因的组织分布及在卵母细胞成熟过程中的表达模式,结果表明：猪Gpr3基因在大脑、小脑、下丘脑、垂体、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、’肾脏、肌肉、脂肪、胸腺、卵巢、输卵管、子宫、睾丸、卵母细胞和颗粒细胞中均有表达,但仅在脑、垂体、肝脏、脂肪、子宫和卵母细胞中大量表达,推测其在猪的神经系统及生殖系统发育和功能维持方面具有重要作用,可能参与猪的脂肪代谢。另外,Gpr3基因在猪卵母细胞体外成熟过程中的表达量呈下降趋势,并且与卵丘扩散程度呈显着的负相关（r=-0.937,P<0.01）,表明其可能对卵丘扩散和卵母细胞成熟具有重要作用。成熟促进因子（Maturation promoting factor, MPF）的调节亚基Cyclin B1基因在卵母细胞体外成熟前期的表达量较低（0-24h）,后期显着的升高（24-44h）,而催化亚基CDK1基因的表达水平在整个培养过程中保持相对稳定,说明MPF可能主要在卵母细胞体外成熟后期发挥作用。3用免疫组织化学方法检测Gpr3蛋白在9个阶段猪卵巢组织中的表达与定位,结果表明：在胎儿和新生期,Gpr3主要在卵母细胞巢中的卵原细胞、原始卵泡和初级卵泡的卵母细胞中表达；在生后期,Gpr3在腔前卵泡和有腔卵泡的颗粒细胞层、卵丘细胞和卵母细胞胞质中表达,并且在卵母细胞中的表达量最高。另外,在成年猪卵巢的黄体中也有微弱的表达。Real-time PCR和Western blotting结果表明,Gpr3mRNA和蛋白在不同发育阶段猪卵巢中均有表达,表达量呈波浪状变化,在新生及出生后140日龄的表达量最高；在不同品种猪的卵巢中,Gpr3的表达量趋于一致,未见显着性差异；在不同直径猪卵巢卵泡中,Gpr3的表达量随着卵泡直径的增加而上升。猪Gpr3受体在卵巢中的细胞和时期特异性表达模式表明,其可能在猪卵泡发育和黄体形成过程中发挥重要作用。4为了探究Gpr3的性质功能并筛选其潜在的配体,我们构建了Gpr3真核表达载体及与GFP融合表达载体,用以检测Gpr3在人胚肾（HEK293）细胞中的亚细胞定位、组成性活性、鞘脂类脂质对组成性活性和受体内化的影响。结果表明：在HEK293细胞中,Gpr3的表达引起了腺苷酸环化酶（adenylate cyclase, AC）组成性激活,并且激活程度与完全激活Gs偶联受体的程度相似。而且,鞘氨醇1-磷酸（sphingosine1-phosphate, S1P）可以通过组成性激活的Gpr3受体进一步增加AC的活性。当在HEK239细胞中表达绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）标记的Gpr3受体时发现,绿色荧光仅集中于细胞膜和亚细胞膜中。S1P处理后,通过荧光共聚焦显微镜可以观察到激动剂诱导的受体内化过程。而鞘氨醇（sphingosine, Sph）和鞘磷脂（sphingomyelin, Sphi）不具备以上功能。说明,Gpr3是组成性激活的G蛋白偶联受体,它的组成性活性及激动剂诱导的内化作用受到脂质调节者S1P的调控,表明S1P可能是猪Gpr3受体的潜在激动剂。5为了研究Gpr3信号通路在猪卵泡颗粒细胞中的作用,本研究从猪卵巢卵泡（3-5mm）内分离颗粒细胞（pGCs）进行体外培养。采用RNAi技术“沉默”Gpr3阻抑其介导的信号通路,以检测Gpr3受体在猪卵泡颗粒细胞生长及分化过程中的作用。结果表明：转染Gpr3特异性的siRNA后,能够有效地抑制颗粒细胞中Gpr3mRNA和蛋白的表达,成功地阻抑了Gpr3介导的信号通路。MTT、流式细胞术及RIA检测的结果表明,阻抑Gpr3信号通路能够促进颗粒细胞增殖,抑制颗粒细胞凋亡,但对颗粒细胞中类固醇激素的合成没有影响。另外,阻抑Gpr3信号通路显着改变了Cyclin B1、 Cyclin D2、Bcl-2、Bax和Gprl2的表达（P<0.05）,而对CDK1、CDK4、P450arom、 P450scc和Gpr6的表达没有影响（P>0.05）。6为了进一步明确Gpr3在猪颗粒细胞中的功能,我们在颗粒细胞中超表达了Gpr3受体,结果表明：超表达Gpr3能显着抑制颗粒细胞的增殖,增加G0/G1期细胞的百分含量,减少S期的细胞,同时降低细胞周期标志蛋白Cyclin B1和CDK1的mRNA表达；超表达Gpr3能显着增加颗粒细胞的凋亡比率,抑制Bcl-2的表达,促进Bax的表达；超表达Gpr3促进了Gpr6的表达；然而,超表达Gpr3不影响雌二醇和孕酮的分泌,并且未显着改变P450arom和P450scc的表达。由此可见,Gpr3信号通路在调控猪卵泡颗粒细胞生长和凋亡过程中具有重要的作用,相关基因表达量的改变为进一步探索Gpr3受体在调节卵泡颗粒细胞生长及凋亡过程的中作用机制奠定了一定的基础。
张远青[5]（2012）在《Vasa、卵泡抑素（FST）和抗缪勒氏管激素（AMH）在半滑舌鳎繁殖周期中的作用研究》文中指出半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis Günther）是我国近海的大型名贵经济鱼类。本研究利用分子生物学和mRNA原位杂交技术，分析了Vasa、卵泡抑素（follistatin，FST）、抗缪勒氏管激素（anti-mullerian hormone,AMH）在半滑舌鳎繁殖周期中的功能，所得结果与结论如下：1.半滑舌鳎Vasa基因的克隆和表达本研究克隆了半滑舌鳎Vasa基因的cDNA序列，其全长2602bp，编码包含722个氨基酸残基的蛋白质，有一个经选择性剪切形成的亚型。推导的氨基酸序列含有DEAD-box家族特有的8个保守,N末端含有5个RGG重复和10个RG重复。组织表达分析表明，Vasa基因在性腺中表达量丰富，性腺外组织仅在心脏中有微量表达。利用RT-PCR和mRNA原位杂交技术研究了csVasa在性成熟半滑舌鳎繁殖周期的表达模式。在卵巢中，Vasa的表达量在初级卵黄期和囊泡期要显着高于核周期和退化吸收期；精巢中，Vasa在精子细胞增殖期的表达量要明显高于精母细胞增殖期和精子成熟期。这些结果表明，Vasa可能在半滑舌鳎的配子发生中起重要作用。初级卵黄期卵巢的Vasa mRNA原位杂交结果显示，Vasa mRNA在Ⅲ期卵母细胞的胞质中均匀分布，外周皮层信号强度较高。2.半滑舌鳎FST基因的克隆和表达采用RACE技术克隆得到了半滑舌鳎FST的cDNA序列，其全长1455bp，编码包含321个氨基酸残基的蛋白质，属于TGFβ家族。组织表达分析表明，FST在半滑舌鳎13中组织中均有表达，其中在性腺中表达最高，脑和鳃中表达量较高，证明FST具有广泛的生理作用。利用RT-PCR技术研究了FST在性成熟半滑舌鳎繁殖周期的表达模式。在卵巢中，FST的表达量核周期最高，初级卵黄期和囊泡期较高，推测FST抑制FSH刺激的卵母细胞发育的作用，而对LH无明显作用；精巢中，FST在各个时期均有表达，并且精子细胞增殖期表达量较低，推测这是因为FST对芳香化酶的调节功能所致。3.半滑舌鳎AMH基因的克隆和表达采用RT-PCR技术克隆得到了半滑舌鳎AMH的cDNA片段序列，长度955bp，编码318个氨基酸，属于TGFβ家族。组织表达分析表明，AMH在仅半滑舌鳎的性腺中表达，并且在精巢中的表达量要高于卵巢。利用RT-PCR技术研究了AMH在性成熟半滑舌鳎繁殖周期的表达模式。在卵巢中，AMH在初级卵黄期和囊泡期表达量较高，在退化吸收期最高，推测鱼类的AMH与哺乳类一样具有抑制FSH的作用。研究还发现，在雌性半滑舌鳎繁殖期中，AMH可能具有抑制LHR表达的功能。精巢中，AMH在精母细胞增殖期表达量最高，进入繁殖期后表达量显着下降，与AMH在哺乳动物进入青春期后被睾酮（T）抑制相一致，证明在鱼类中AMH同样被T抑制。此外，AMH具有阻止精子发生启动的生理功能。
赵中权[6]（2011）在《抑制素对山羊繁殖力的影响》文中提出抑制素（Inhibin,INH）是雄性动物睾丸支持细胞（Sertoli cells）和雌性动物卵巢颗粒细胞（Granulosa cells）分泌的二聚体糖蛋白激素。活化素（Activin, ACT）又名激活素,是最早在性腺中发现的一种糖蛋白激素。在结构上,INH基因由α亚基和β亚基（pA或pB）通过二硫键连接形成INHA （α-βA）和INHB （α-βB）两种形式,ACT由pA和pB亚基相互通过二硫键连接后形成ACTA （βA-βA）、ACTB （βB-βB）和ACTAB （βA-βB）三种形式。在雌性动物中,INH和ACT分别起到抑制和促进卵泡刺激素（Follicle-stimulating hormone, FSH）的合成和分泌的作用。本实验旨在研究抑制素在激素水平和基因水平上对不同繁殖力山羊品种（遗传资源）的影响情况,试图揭示抑制素对山羊繁殖力影响的遗传机制。1.山羊血浆中INHB、ACTA和FSH含量比较分析采用酶联免疫法（ELISA）测定并分析了大足黑山羊（n=5）、南江黄羊（n=5）和萨能奶山羊（n=4）3个山羊品种（遗传资源）在一个发情周期内FSH、INHB和ACTA三种激素的分泌变化规律,得到以下结果：（1）大足黑山羊发情周期为（20.1±0.5）d,南江黄羊的发情周期为（20.2±1.1）d,萨能奶山羊发情周期为（25.1±0.8）d。（2）在整个发情周期中,3个山羊品种（遗传资源）FSH分泌曲线中高峰点出现的时间和INHB分泌曲线中较低点出现的时间基本一致,FSH与INHB在3个羊种中都呈现极显着负相关（P<0.01）。3个山羊品种（遗传资源）的ACTA分泌变化趋势与FSH分泌变化趋势也比较一致,ACTA与FSH相关系数为正值,但均未达到差异显着水平（P>0.05）（3）大足黑山羊FSH在发情周期中出现的第1个分泌高峰点的水平显着高于南江黄羊和萨能奶山羊（P<0.05）；而大足黑山羊INHB在发情周期中出现的第1个分泌较低点的水平显着低于萨能奶山羊和南江黄羊（P<0.05）2.山羊INHα、INHβA和INHβB亚基基因的克隆和序列分析以大足黑山羊（n=3）、南江黄羊（n=3）和萨能奶山羊（n=3）为研究对象,采用RT-PCR技术克隆出INHα、INHβA和INHβB亚基基因cDNA序列,并已获得两个NCBI登录号（INHα:HQ699620和INHβA:HQ699621）,与GenBank中其它物种的相同亚基相同区段的同源性均在95%以上。（1）山羊INHα、INHβA和INHβB亚基基因cDNA序列分别为1124 bp、1364bp和1499 bp; CDS区分别为1083 bp、1278 bp和1227 bp;CDS区分别编码360、425和408个氨基酸,分别包含18、21和20个氨基酸信号肽,341、404和380个氨基酸成熟肽。CDS区编码的氨基酸与GenBank中其它物种相同亚基的相同区段编码的氨基酸同源性达96%以上。（2） INHα、INHβA和INHβB多肽相对分子质量分别为94.655 KD、109.132KD和100.438 KD,等电点（pI）分别为4.95、4.92和4.94,疏水性最小值分别为-0.467、-0.633和-0.567,最大值分别为2.344、2.422和2.267。均无蛋白跨膜区；蛋白的二级结构中,α螺旋分别占17.22%、21.65%和23.04%,β转角分别占5.28%、3.53%和4.41%,延伸链分别占18.89%、19.53%和18.14%,无规卷曲分别占58.61%、55.29%和54.41%。INHβA和INHβB多肽的三级结构均与人的INHβA多肽有116个氨基酸残基相匹配。（3）所测山羊INHα亚基基因cDNA序列与GenBank中绵羊（Ovis aries）外显子2比较,共发现19个变异位点,其中转换17个,颠换2个,氨基酸变异位点为8个；与NCBI上公布的波尔山羊（Capra hircus）外显子1和2部分序列相比,共发现3个变异位点,其中转换2个,颠换1个,氨基酸变异位点为2个,分别为第338位（外显子2第32位）C→G的突变导致氨基酸L→V,第345位（外显子2第39位）A→G的突变导致氮基酸Q→R。（4）所测山羊INHβA亚基基因cDNA序列与GenBank中绵羊相同区段相比,发现有10个碱基变异位点,均为转换,无颠换、插入或后缺失,其中CDS区第198位（cDNA）序列的第211位)A→G的突变导致氨基酸R→K。（5）所测山羊INHβB亚基基因cDNA序列与GenBank中绵羊序列相比,出现了12个变异位点,其中有5个转换,6个颠换,1个插入。引起氨基酸变异的位点有3个,860位G→T的变异导致氨基酸R→L,第871位插入碱基G使得氨基酸序列增加了一个G,第1372位G→T的突变使得氨基酸G→V。在大足黑山羊中却没有发现这3个位点的突变。3.山羊INHα、INHβA和INHβB亚基基因的外显子遗传多态性分析采用序列测定和PCR-SSCP技术,在大足黑山羊（n=28）和南江黄羊（n=27）中分析INHα、INHβA和INHβB亚基基因的外显子遗传多态性,结果发现：（1） INHα亚基基因外显子1内没有多态性位点,外显子2内都存在第32位（cDNA序列第338位）C→G和第39位（cDNA序列第345位）A→G的突变；INHβA亚基基因外显子部分序列中没有发现多态性位点；INHβB亚基基因两个外显子中没有发现多态性位点。（2）在更大群体中测序发现山羊INHa亚基基因的外显子2的第57位（cDNA序列第363位）存在G→A的突变,并引起了氨基酸R→H。（3） INHa亚基基因的外显子2 PCR-SSCP分析发现,在大足黑山羊和南江黄羊中出现了三种基因型（AA、AB和BB型）,大足黑山羊AA、AB和BB基因型频率分别为0.071、0.429和0.500,而南江黄羊分别为0.391、0.435和0.174；大足黑山羊B等位基因频率（0.714）高于A等位基因频率（0.286）,南江黄羊A等位基因频率（0.630）高于B等位基因频率（0.370）；经χ2检验发现,大足黑山羊和南江黄羊都处于Hardy-Weinberg平衡状态（P>0.05）。（4） INHa亚基基因的外显子2的多态性与产羔数的最小二乘分析发现,就前三胎产羔数、前二胎产羔数、前一胎产羔数和平均产羔数,大足黑山羊的BB型个体分别比AB型个体多0.595、1.01、0.703和0.769只（P<0.05）；南江黄羊BB型个体比AB型个体产羔数分别多了0.787、1.375和0.754只（P<0.05）,比AA型个体的产羔数分别多了0.849、1.486和1.131只（P<0.05）,但AA与AB型个体之间的差异未达到显着水平（P>0.05）；南江黄羊BB和AB型个体的前一胎产羔数分别比AA型个体多1.01和0.983只（P<0.05）,但AB型与BB型个体之间的差异未达到显着水平（P>0.05）4.山羊INHa, INHβA和INHβB亚基基因定量表达分析以大足黑山羊（n=7）、南江黄羊（n=7）和萨能奶山羊（n=7）为研究对象,采用实时荧光定量PCR技术测定了山羊INHa, INHβA和INHβB亚基基因定量表达情况,结果发现：（1） INHa、INHβA和INHβB亚基基因在山羊的垂体、卵巢、心脏、肝、脾脏、肺和肾脏7种组织均有表达,卵巢组织表达水平高于垂体（P<0.05）；在卵巢和垂体组织中,3个山羊品种（遗传资源）中均表现出INHa表达水平最高、INHβA居中、INHPB表达水平最低。（2）在3个山羊品种（遗传资源）中,大足黑山羊的INHa、INHPA和INHβB亚基基因表达水平的各个组织中最低,萨能山羊居中,南江黄羊最高（P<0.05）。（3）相关性分析发现,卵巢组织INHa、INHβA和INHβB亚基基因表达水平与山羊采样时前一胎的产羔数呈负相关（P<0.10）。5.结论综上所述,得到如下结论：（1）在一个发情周期中,3个山羊品种（遗传资源）FSH水平与1NHB水平呈负相关,FSH水平与ACTA水平呈正相关,激素变化趋势与山羊卵泡发育波的出现基本吻合。（2）在一个发情周期中,伴随着最后一个卵泡发育波出现的较大量FSH分泌和较低水平的INHB分泌以及抑制素基因较低的表达水平可能与山羊的高繁殖力相关。（3）在山羊INHa亚基基因外显子1、INHβA亚基基因外显子部分序列和INHβB亚基基因两个外显子中没有发现多态性位点,这些亚基基因外显子序列对山羊的产羔数影响可能较小。（4）山羊INHa外显子2的第57位存在G→A的突变,并引起了氨基酸R→H,在不同个体中出现了三种基因型（AA、AB和BB型）。INHa外显子2的B等位基因可能是山羊高繁殖力的一个优势基因,INHa外显子2有可能作为山羊多胎性标记辅助选择的候选基因片段。（5） INHa、INHβA和INHβB三个亚基基因在山羊卵巢组织表达水平高于垂体。在山羊卵巢和垂体组织中,INHa亚基基因表达水平最高、INHβA居中、INHβB表达水平最低。
吴风瑞[7]（2010）在《罗非鱼卵巢分化和发育相关基因Rspo1、β-catenin和TSP-1的克隆、表达和功能鉴定》文中研究指明近年来大量研究发现哺乳动物雌性性别决定和分化是在性腺体细胞Fox12和生殖细胞Wnt4/Rspo 1/β-catenin两条通路的严格控制之下而完成的,β-catenin是雌雄信号拮抗过程中的重要蛋白。对硬骨鱼类而言,其性别决定除受遗传基因控制外,雌激素（在硬骨鱼类由Cyp19a1a编码）在卵巢分化过程中起着决定性诱导作用,是卵巢分化的天然诱导剂。长期以来,Wnt4/Rspo 1/β-catenin通路在硬骨鱼类是否存在以及其在性别决定和分化过程中的作用、对Cyp19a1a否存在调控、与Fox12和Dmrt1控制的体细胞雌激素合成的关系未见报道。本研究首先从罗非鱼克隆了Rspo1和由两个不同基因编码的β-catenin（缩写β-cat,分别命名为β-cat-1和-2）。序列分析发现硬骨鱼类Rspo1、β-catenin氨基酸序列具有较高的保守性,系统发生分析表明两种β-catenin在硬骨鱼类是一种普遍现象,可能源于进化过程中硬骨鱼类特有的基因组复制。另外,我们采用RT-PCR的方法对罗非鱼Rspo1和β-catenin在各组织中的表达模式进行了研究,发现Rspo1呈泛表达的模式,β-cat-1和-2在脑、垂体、鳃、心脏、肾脏、肠、肾脏和性腺中表达。就性腺而言,β-cat-1只在卵巢中表达,Rspol和β-cat-2在卵巢中的表达要高于精巢。原位杂交研究发现罗非鱼Rspo1、β-cat-1和-2都表达于卵巢中3时相及其以前的卵母细胞,而不表达于卵巢体细胞,Rspo1还表达于精原细胞和精母细胞。在孵化后10天的罗非鱼卵巢中就能检测到β-cat-1和-2的表达信号,且伴随着卵巢发育二者表达量逐渐升高,直至3时相卵母细胞。通过免疫组化还发现罗非鱼β-catenin在卵巢中的蛋白表达水平远远高于精巢,从而证明在硬骨鱼类存在Rspo1/β-catenin介导的生殖细胞通路,暗示了其可能在硬骨鱼类卵巢分化和发育中具有重要作用。因此,本研究进一步采用荧光素酶报告基因系统研究了β-catenin是否影响Cyp19a1a转录活性以及生殖细胞Rspo1/β-catenin通路与已知性腺体细胞Fox12和Dmrt1控制的雌激素合成通路之间的关系。结果发现,在HEK293细胞中,罗非鱼β-cat-1和-2单独都不能激活Cyp19a1a的转录,但二者均可以增强Sf1激活的Cyp19a1a启动子活性；Fox12和β-cat-2协同增强Sf1激活的Cyp19a1a启动子活性,Dmrt1则能抑制β-cat-2增强和Sf1激活的Cyp19a1a启动子活性。以上结果表明Wnt/Rspo 1/β-catenin信号通路可能会和Fox12、Dmrt1一起通过调控Cyp19a1a转录和雌激素合成从而影响硬骨鱼类的性别决定和分化。在硬骨鱼类,雌激素不仅对卵巢分化和发育有重要作用,而且在后期卵巢功能维持上也必不可少,如硬骨鱼类卵巢周期性发育过程也同样需要大量雌激素的参与。细胞外基质蛋白凝血酶敏感素-1（Thromobospondin-1, TSP）是脊椎动物滤泡发生和卵巢周期性发育的重要因子,为了进一步研究TSP-1在硬骨鱼类性腺发育和产卵周期中的作用以及与雌激素的关系,本研究从罗非鱼和青鳉卵巢中均克隆了由两个不同基因编码的凝血酶敏感素TSP-1a和-1b,对脊椎动物TSP-1进行系统发生分析发现,两种TSP-1仅存在于硬骨鱼类。原位杂交结果发现TSP-1b从孵化后5天就开始在罗非鱼雌雄性腺体细胞中表达,在成体卵巢和精巢中则分别表达于鞘膜细胞和输出小管上皮细胞,TSP-1a从孵化后120天开始特异性表达于卵巢的颗粒细胞,这一结果暗示了TSP-1a可能参与了罗非鱼的卵黄发生,TSP-1b参与罗非鱼早期的性腺分化。在罗非鱼14天／产卵周期中,TSP-1a和-1b都在产卵后5天（卵黄发生期）和12天（卵子成熟期）出现两个峰值,这种表达变化规律与对罗非鱼产卵周期中激素水平如雌激素以及FSH和LH的变化研究一致,表明了它们可能通过影响卵巢体细胞中激素的合成而参与了罗非鱼卵巢周期性发育。此外,硬骨鱼类卵巢分化和发育离不开卵巢局部（包括体细胞和生殖细胞）因子的参与,它们连接成网,相互影响,通过自分泌或旁分泌的方式产生的雌激素。为了研究性腺局部因子在南方鲇卵巢分化和发育中的作用,我们还从南方鲇卵巢中克隆了促性腺激素GtHα、FSHβ和LHβ三个亚基的cDNA序列作为本研究的一个组成部分（附录部分）。这三个亚基除在垂体表达之外还在卵巢中特异性表达。在卵巢中,GtHα、FSHβ在孵化后25天就开始表达,LHβ在孵化后40天开始表达,与南方鲇原始生殖细胞有丝分裂和卵原细胞快速增殖的起始时间基本一致,说明性腺局部FSH和LH可能参与了南方鲇原始细胞增殖和早期卵巢发育。当用雌激素受体拮抗剂Tamoxifen对孵化后5天的南方鲇全雌幼鱼进行一定时间的处理后,发现三个亚基的表达水平出现了不同程度的下调,并出现了部分性逆转的现象。因而,我们推测南方鲇卵巢局部产生的促性腺激素很可能通过“脑-垂体-性腺”轴和其他性腺局部因子一起直接或间接影响雌激素合成从而影响南方鲇早期卵巢分化和发育。综上所述,本研究克隆了罗非鱼Rspo1/β-catenin信号通路重要分子Rspo1、β-catenin和细胞外基质主要成分TSP-1以及南方鲇促性腺激素三个亚基,研究了它们的组织和细胞表达模式,并通过荧光素酶报告基因首次研究了罗非鱼β-catenin对Cyp19a1a启动子活性的影响。本研究不仅初步阐明Rspo1/β-catenin所介导的生殖细胞信号通路在硬骨鱼类卵巢分化和发育中作用,也将其与已知的Fox12和Dmrt1体细胞控制的雌激素合成调控途径相偶联,进一步丰富了硬骨鱼类雌激素合成理论,并提出了以雌激素为核心的硬骨鱼类性腺体细胞和生殖细胞相互作用研究的新思路,为揭示脊椎动物特别是硬骨鱼类卵巢分化和发育以及体细胞和生殖细胞之间的相互作用的分子机制提供基础的理论依据。
何小龙[8]（2010）在《蒙古羊BMPR-IB、FSHβ基因克隆与表达及卵巢组织差异表达基因研究》文中研究说明绵羊的繁殖性状一般分为受胎率、多胎率及羔羊存活率三类性状,繁殖性能的高低直接关系到养羊业生产成本和生产效率,具有重大的经济意义。蒙古羊是我国最古老的地方绵羊品种之一,乌珠穆沁系蒙古羊是在当地生态环境条件下,经长期选育形成的一个优良类群,具有许多优良特性,主要以抗病力强、产肉率高和繁殖性能高而闻名。为了揭示蒙古羊高繁殖性能,使蒙古羊这一宝贵资源能得到有效利用,本研究以乌珠穆沁系蒙古羊为实验材料,首先以BMPR-IB和FSHβ基因作为蒙古羊高繁殖力候选基因,对其进行了克隆及序列分析,并采用实时荧光定量PCR（RQ-PCR）的相对定量方法对BMPR-IB和FSHβ基因在单羔蒙古羊非发情期、发情期及产双羔蒙古羊怀孕后期的卵巢、子宫、输卵管、下丘脑和垂体组织进行了差异表达研究;其次采用抑制性消减杂交技术（SSH）对经产单、双羔蒙古羊的卵巢组织差异表达基因进行了筛选并采用电子克隆加RT-PCR方法对部分差异表达基因进行了克隆和验证。通过以上研究,为提高我国肉用绵羊繁殖力及加快肉羊新品种选育提供了重要的理论依据,并获得以下主要研究结果:（1）采用RT-PCR方法分别从蒙古羊卵巢组织中扩增出BMPR-IB、FSHβ基因的cDNA序列。蒙古羊BMPR-IB基因全长1567bp,包括完整的1509bp开放读码框（ORF）,共编码502个氨基酸。通过对单、多胎蒙古羊BMPR-IB基因测序结果分析发现,在单、多胎蒙古羊BMPR-IB基因编码区第746位和第1113位碱基相一致,分别为“A”和“C”,并没有发生同多胎Booroola羊相同的A→G突变和C→A突变。蒙古羊FSHβ基因全长1021bp,包括完整的390bp ORF,共编码129个氨基酸。（2）采用相对定量的双标准曲线法建立了蒙古羊β-Actin、BMPR-IB和FSHβ基因的RQ-PCR反应体系。以非发情期单羔蒙古羊的卵巢组织定量结果为对照,计算得到FSHβ基因在单羔蒙古羊发情期下丘脑组织中表达量最高,在发情期的输卵管组织中表达量最低;BMPR-IB基因在单羔蒙古羊发情期卵巢组织中表达量最高,在发情期的子宫组织中表达量最低。在卵巢组织中,FSHβ基因在发情期卵巢组织中的表达量是非发情期的1.31倍,双羔羊是单羔羊的0.70倍;BMPR-IB基因在发情期卵巢组织中的表达量是非发情期的2.65倍,双羔羊是单羔羊的2.16倍。证明BMPR-IB基因是蒙古羊多胎主要候选基因,FSHβ基因虽然在绵羊繁殖过程中具有重要的作用,但并非蒙古羊多胎主效基因,可能与多胎性状的主基因或QTL相连锁。（3）采用SSH技术成功构建了单、双羔蒙古羊卵巢组织的正、反向消减cDNA文库,并从两个消减cDNA质粒文库中筛选得到768个有效阳性克隆,插入片段长度主要分布于1501000bp之间。结合斑点杂交技术获得到差异克隆373个,通过测序和同源性检索获得已知基因序列185条,10条已知的差异表达EST和4条未知的EST序列。（4）对差异表达基因功能分析表明,本实验所获得的基因主要由以下几大类组成:机体和细胞防御、免疫类14个,代谢类53个,物质运输类20个,核酸修饰类12个,细胞发育类18个,信号传导类12个,细胞结构类9个,未分类47个,其中代谢类基因占据了最大部分占28.65%。将这些差异表达基因和已报道的与繁殖性状相关的基因比较发现,经过初步筛选得到12个差异表达基因与已报道的繁殖性状相关基因相一致,这些基因分别为ITGB1、BMP6、MHC-I、ACVRL1、IGFBP5、SPON1、FABP5、ADAMTS1、FAM46A、THY1、ARP3和Id3基因。（5）分别以SSH获得的差异表达ADAMTS1和Id3基因序列片段为种子序列在绵羊的EST数据库中进行blastn同源性检索,得到相应的UniGene编号分别为Oar.7453和Oar.5068,经过序列拼接分别得到2418bp和1099bp的蒙古羊ADAMTS1、Id3基因电子克隆cDNA序列。采用RT-PCR方法实验克隆得到2420bp的蒙古羊ADAMTS1基因序列和1045bp的蒙古羊Id3基因序列,经同源性比对发现,实验所得序列与电子延伸序列的同源性分别为99.4%和99.3%,并将序列提交至GenBank获得注册号分别为:GU437212和GU437213。
滑国华[9]（2009）在《山羊产羔和牛精液品质与卵泡发育性状主基因鉴定及功能研究》文中研究说明牛和羊是重要的节粮型畜种,可为人类提供肉、奶、皮、毛等优质的畜产品。然而,牛是单胎动物,羊是少（寡）胎动物,自然繁殖力低是制约这两种动物生产经济效益的主要原因。因此,研究牛羊繁殖基础理论,开发提高牛羊繁殖力的育种和繁殖新技术具有重要意义。培育繁殖力高的新品种是提高牛羊繁殖力的重要手段,分析牛羊繁殖性状分子遗传规律和调节机制,开发分子标记辅助选择技术,是培育新品种的基础。牛羊繁殖性状是重要的经济性状,也是复杂的数量性状,受微效多基因控制,同时也受一个或几个主基因控制,筛选鉴定繁殖性状主基因并阐明其作用机制,研究其对卵泡发育的调控作用,对于开发提高牛羊繁殖力的新技术（如胚胎工程、繁殖控制等）,建立分子育种技术（如标记辅助选择、转基因育种等）,快速改良和提高牛羊繁殖性能具有重要的理论和实际意义。本研究从检测主要生殖激素、次要生殖激素和细胞因子基因多态性着手,分析多态性与产羔数、卵泡发育、精液品质之间的关系,鉴定牛和羊主要繁殖性状主基因,并利用RNA干扰技术鉴定主基因功能,探讨其作用机制,为建立高繁殖力牛羊繁殖和育种新技术奠定理论基础,提供技术支撑。1.山羊产羔和牛精液品质与卵泡发育性状主基因鉴定利用候选基因法,采用PCR-SSCP、PCR-RFLP和Forced PCR-RFLP等技术,分析了FecB、FecX（包括FecXI、FecXH、FecXB和FecXG）、与FecB和FecX连锁的5个微卫星标记（BMS2508、OARHH35、BM143、BM1329和TGLA68）、GH和INHA在6个山羊品种/群体（波尔山羊、海门山羊、黄淮山羊、马头山羊、努比山羊和波淮杂交一代羊）共计614个样本中的多态性,及候选基因或微卫星多态性对山羊产羔和生长性状的影响,鉴定山羊产羔性状主基因,筛选相关分子标记;同时采用PCR-RFLP技术研究了INHβA在荷斯坦种公牛中的多态性,及其对精液品质性状的影响,筛选分子标记,并鉴定荷斯坦种公牛精液品质性状主基因,发现:（1）绵羊繁殖性状主基因FecB（BMPR-IB突变体）、FecX（包括FecXI、FecXH、FecXB和FecXG,均为BMP15突变体）在波尔山羊、海门山羊、黄淮山羊、马头山羊、努比山羊和波淮杂交一代6个品种/群体共计614只羊中不存在多态性,即山羊BMPR-IB的突变体FecB和BMP15的突变体FecX不是山羊产羔性状主基因;（2）与FecB（BMPR-IB突变体）连锁的4个微卫星座位（BMS2508、OARHH35、BM143和BM1329）及与FecX（BMP15突变体）连锁的微卫星座位（TGLA68）在山羊中存在多态性,且不同基因型对波尔山羊产羔数性状影响显着;说明BMPR-IB和BMP15是山羊产羔性状主基因,在这两个基因中可能存在除FecB和FecX外的其他主效位点控制山羊产羔性状;（3）在波尔山羊GH基因中检测到2个SNPs（A781G和A1575G）,在A781G位点检测到AA和AB两种基因型,BB基因型缺失,在A1575G位点检测到CC和CD两种基因型,DD基因型缺失;GH基因对波尔山羊的基因效应存在性别差异,对波尔山羊公羊早期生长性状调控作用显着,是波尔山羊公羊生长性状主基因,但对母羊早期生长性状调控作用不明显;波尔山羊母羊GH基因型间产羔数无统计差异（p＞0.05）;GH是否对山羊产羔数有直接调控作用,尚需进一步研究;（4）在山羊抑制素α亚基基因（INHA）中共检测到11个遗传多态,分别为-506-＞G、-446C＞T、-155C＞T、-65G＞C、129G＞A、567G＞A、651A＞G、792T＞C、906C＞T、911T＞C、946A＞C,其中,911T＞C和946A＞C分别引起该处氨基酸编码改变,即299Val＞Ala和311Thr＞Pro;-446C＞T、651A＞G和946A＞C位点对不同山羊品种产羔数性状影响显着;INHA基因是山羊产羔性状主基因;（5）在荷斯坦种公牛抑制素βA亚基基因（INHβA）中发现StyⅠ-RFLP多态性,检测到AA、AB和BB三种基因型,其中AB基因型是优势基因型;性状关联分析结果表明,INHβA对荷斯坦种公牛精液品质有显着影响,不同基因型对精液品质效应表现为:AB＞AA＞BB;INHβA是控制荷斯坦种公牛精液品质的主基因。2主基因INHA对牛卵泡发育调控机制研究在候选基因研究基础上,利用RNAi技术进一步研究繁殖性状主基因抑制素α亚基基因（INHA）对牛卵泡细胞生长、凋亡和类固醇激素分泌水平的作用及作用机制,并探讨了INHA对卵泡发育和排卵的局部调节作用,发现:（1）所构建的四种重组干扰质粒（psiRNA1、psiRNA2、psiRNA3和psiRNA4）均能有效降低INHA表达量,其中psiRNA3重组质粒干扰效果最显着;（2）利用RNAi技术干扰INHA,牛颗粒细胞凋亡抑制基因bcl-2和bcl-xl表达量上调,凋亡促进基因Bax表达量下调,细胞因子IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ表达量上调;牛颗粒细胞凋亡减少;细胞周期变化显着,G0/G1期颗粒细胞比例减少,S期和G2/M期颗粒细胞比例增加;雌二醇和孕酮水平上调,雌二醇/孕酮比值下调;这些结果说明,抑制素可能通过调控凋亡家族（bcl-2家族）、细胞生长因子（IGF家族）相关基因表达量和类固醇激素分泌量,发挥其在卵巢内部的局部调节作用,抑制颗粒细胞增殖,促进颗粒细胞凋亡,从而抑制卵泡发育和排卵。
陈阿琴[10]（2008）在《湖羊卵泡颗粒细胞相关差异表达基因的筛选和鉴定及抗氧化物对GSTA1表达的影响》文中指出本研究以湖羊卵泡颗粒细胞为试验对象,利用抑制消减杂交技术筛选和鉴定了与湖羊卵泡成熟相关的差异表达基因,探讨了多胎候选基因骨形态蛋白15（BMP15）和生长分化因子-9（GDF-9）受体基因在湖羊卵泡成熟过程中的表达规律,并以体外培养颗粒细胞为模型研究了激素和茶多酚对差异表达基因的影响。这对充分利用湖羊的多胎性能,揭示绵羊卵泡发育的分子机制和改进绵羊胚胎工程技术具有重要的理论意义和应用价值。1.湖羊卵泡颗粒细胞BMP15和GDF-9受体基因表达的变化及激素对其表达的影响湖羊经促卵泡刺激素（FSH）处理后屠宰,将剥离的有腔卵泡分为成熟卵泡（LF,>5mm）和生长卵泡（SF,3-5mm）,分离卵泡颗粒细胞；以体外培养绵羊卵泡（2-5mm）颗粒细胞为模型,添加不同浓度FSH（0、1、5、10 ng/ml）或与E2（1ng／ml）协同作用处理细胞；荧光定量PCR法检测卵泡颗粒细胞中BMPRⅡ、BMPRIB和ALK-5mRNA的表达量。结果显示,与生长卵泡颗粒细胞相比,成熟卵泡颗粒细胞中BMPRⅡ、BMPRIB和ALK-5mRNA的表达量分别提高了1.46、1.86和1.53倍。与对照组相比,添加FSH（1-10ng/ml）显着降低BMPRIB mRNA表达水平（P<0.05）,5ng/mlFSH对BMPRⅡ和ALK-5mRNA表达无显着影响。FSH与E2协同作用使BMPRⅡ、BMPRIB和ALK-5mRNA的表达量较对照组分别提高了2.81、2.76和8.39倍（P<0.01）。以上结果提示,BMP15和GDF-9及其受体基因在绵羊卵泡发育、成熟过程中起重要的作用。BMP15和GDF-9受体基因在绵羊卵泡颗粒细胞中差异表达,其机制可能与FSH和E2协同作用调控有关。2.湖羊成熟卵泡颗粒细胞差异表达基因的筛选和鉴定利用抑制消减杂交技术筛选湖羊卵泡发育分化过程中不同阶段之间差异表达的基因。从分离的成熟卵泡和生长卵泡颗粒细胞中提取总RNA,构建了湖羊卵泡颗粒细胞正、反双向cDNA消减文库。在正、反向文库中,分别随机挑选了384个克隆,再经斑点杂交验证。根据斑点杂交信息,挑选了92个克隆进行单向测序,获得90个EST,聚类后通过BLAST比对,共有38个与已知功能的基因相似,15个与已知但功能未知的基因相似,14个为新EST（Genbank登录号为EY202207,FD480266-FD480278）。荧光定量PCR进一步证实了LAPTM4A、SERPINE2、GSTA1和INHBA在成熟卵泡颗粒细胞的表达量均显着高于生长卵泡颗粒细胞（P<0.05）。本研究中这些差异基因的发现为深入分析绵羊卵泡发育机制尤其是卵泡成熟相关的基因,进而用于绵羊多胎的分子育种奠定了基础。3.湖羊GSTA1的克隆及FSH对其表达的影响克隆了湖羊卵泡颗粒细胞谷胱甘肽S-转移酶Al（GSTA1）基因的cDNA序列,并探讨了FSH对GST酶活性及GSTA1mRNA表达的影响。根据湖羊卵泡颗粒细胞SSH文库鉴定出的GSTA1EST序列,用电子克隆及RT-PCR方法获得了840bp的GSTA1基因序列（GenBank登录号：EU399787）,其开放阅读框长666bp,编码222个氨基酸。推测的湖羊GSTA1氨基酸序列与牛、猪和人GSTA1序列的同源性分别为98%、88%和82%。RT-PCR结果显示：GSTA1在绵羊黄体、肝、肾、睾丸和肺中都有转录,在黄体、肝和睾丸中表达水平较高,肺和肾中表达次之,在心、子宫和垂体中未见明显表达。分别用0、1、5和10ng／ml的FSH处理体外培养的颗粒细胞。结果显示：与对照组相比,10ng/ml FSH使GST酶活性提高了68.8%（P<0.05）,GSTA1mRNA的表达量升高了2.07倍（P<0.05）。上述结果表明,GSTA1基因表达特异性可能与其功能密切相关,且FSH可调控GSTA1mRNA表达,提示GSTA1可在激素调控下参与绵羊卵泡发育,尤其是在卵泡成熟过程中发挥重要作用。4.茶多酚对氧化损伤诱导的绵羊卵泡颗粒细胞凋亡的影响利用次黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶（HX/XO）活性氧自由基产生系统建立绵羊卵泡颗粒细胞氧化损伤模型,通过MTT法、荧光显微镜观察、分光光度法、流式细胞仪检测、荧光定量PCR,探讨茶多酚（GTPs）对氧化损伤诱导的绵羊卵泡颗粒细胞凋亡和GSTA1表达的影响。结果显示,HX／XO（1mM／l；1mU／ml）可通过氧化损伤诱导颗粒细胞凋亡,以剂量效应使颗粒细胞GSH水平和GST酶活性显着降低,MDA形成增加（P<0.05）,同时可使GSTA1mRNA表达水平显着降低（P<0.05）。低浓度GTPs（<10μg/ml）对颗粒细胞的生长、分化无显着影响,高浓度GTPs（>20μg/ml）对颗粒细胞增殖有抑制作用;与HX/XO组相比,GTPs（5,10μg/ml）能显着缓解HX/XO系统引起的颗粒细胞氧化损伤,使存活的细胞数目显着增加（P<0.05）；GTPs（10μg/ml）处理可提高HX/XO诱导的颗粒细胞GST酶活和GSH水平降低,抑制MDA的产生（P<0.05）,同时显着提高GSTA1mRNA表达水平。研究表明,GTPs可抑制氧化应激诱导的绵羊卵泡颗粒细胞凋亡,其机制可能与GTPs调控GSH-GST途径及GSTA1表达有关。
二、人卵巢颗粒细胞雌激素β型受体cDNA的克隆和序列分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人卵巢颗粒细胞雌激素β型受体cDNA的克隆和序列分析（论文提纲范文）
（1）ERK信号通路相关基因在番鸭不同时期卵巢中的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 番鸭的生物学特性和养殖现状 |
| 2 家禽就巢性的分子机制研究 |
| 2.1 番鸭生殖发育机理分析 |
| 2.2 家禽就巢性研究进展 |
| 2.3 就巢相关通路研究进展 |
| 3 MAPK信号转导途径简介 |
| 3.1 ERK信号通路 |
| 3.2 p38 MAPK信号通路 |
| 3.3 JNK信号通路 |
| 3.4 ERK5信号通路 |
| 4 ERK信号通路在动物卵巢发育过程中的研究进展 |
| 5 本研究的内容和目的意义 |
| 5.1 研究的内容 |
| 5.2 目的与意义 |
| 第二章 番鸭ERK2基因和GRB2基因全长CDNA的克隆及表达分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 试剂和仪器 |
| 1.3 引物设计与合成 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 SMART-RACE技术获取ERK2和GRB2基因全长 |
| 2.2 目的基因的生物信息学分析 |
| 2.3 实时荧光定量PCR |
| 2.4 数据的处理及分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 各组织Total RNA的纯度和完整性检测结果 |
| 3.2 番鸭ERK2基因检测结果 |
| 3.3 番鸭GRB2基因检测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 ERK2基因序列特点及表达特征 |
| 4.2 GRB2基因序列特点及表达特征 |
| 第三章 ERK信号转导通路相关基因在番鸭卵巢发育过程中的表达谱及其分层聚类学分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要仪器和试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 主要的分析软件和生物信息学网站 |
| 2.2 RNA提取 |
| 2.3 RNA反转录及cDNA验证 |
| 2.4 实时荧光定量PCR反应体系及条件 |
| 2.5 番鸭ERK信号通路相关基因在不同时期下的表达谱的分层聚类分析 |
| 2.6 番鸭ERK信号通路相关基因在不同时期下的相互作用网络构建 |
| 2.7 ERK信号通路相关基因荧光定量引物设计 |
| 3 结果 |
| 3.1 总RNA的提取和cDNA的制备 |
| 3.2 不同时期卵巢中22个基因的表达分析 |
| 3.3 番鸭ERK信号通路相关基因的分层聚类学分析 |
| 3.4 番鸭ERK信号通路相关基因在不同时期卵巢中的分子网络构建 |
| 4 讨论 |
| 4.1 ERK信号通路相关基因的分析 |
| 4.2 ERK信号通路相关基因的调控网络 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间的学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
（2）济宁青山羊和沂蒙黑山羊ERα和ERβ全基因克隆与多克隆抗体的制备及应用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 下丘脑-垂体-卵巢轴研究进展 |
| 1.2 雌激素及雌激素受体研究进展 |
| 1.2.1 雌激素 |
| 1.2.2 雌激素的作用机制 |
| 1.2.3 雌激素受体的发现 |
| 1.2.4 雌激素受体的结构 |
| 1.3 雌激素受体的分布 |
| 1.3.1 人生殖系统中雌激素受体分布 |
| 1.3.2 鼠生殖系统中雌激素受体分布 |
| 1.3.3 牛生殖系统中雌激素受体分布 |
| 1.3.4 绵羊和山羊生殖系统中雌激素受体分布 |
| 1.4 雌激素受体的功能 |
| 1.4.1 雌激素受体在卵巢中的定位与功能 |
| 1.4.2 雌激素受体基因结构与功能 |
| 1.5 雌激素受体的检测方法 |
| 1.5.1 免疫组化法 |
| 1.5.2 Western Blot 法 |
| 1.5.3 原位杂交技术 |
| 1.5.4 荧光定量 PCR 法 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验质粒载体和菌株 |
| 2.1.3 主要试剂与药品 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 实验地点 |
| 2.1.6 主要溶液试剂的配制 |
| 2.1.7 试验前器材的准备 |
| 2.1.8 主要生物学数据库和生物学软件 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 济宁青山羊和沂蒙黑山羊 ERα和 ERβ全基因的克隆 |
| 2.2.1.1 组织总 RNA 的制备 |
| 2.2.1.2 RNA 质量的鉴定 |
| 2.2.1.3 RT-PCR |
| 2.2.1.4 目的基因的获得 |
| 2.2.1.5 PCR 产物克隆、鉴定与序列分析 |
| 2.2.1.6 济宁青山羊和沂蒙黑山羊 ERα和 ERβ基因的同源性分析 |
| 2.2.1.7 济宁青山羊和沂蒙黑山羊 ERα和 ERβ蛋白功能结构域预测分析 |
| 2.2.2 山羊 ERα和 ERβ基因的原核表达及多克隆抗体的制备 |
| 2.2.2.1 pET32a-ERα和 pET32a-ERβ重组质粒的构建 |
| 2.2.2.2 连接产物的转化 |
| 2.2.2.3 His-ERα和 His-ERβ融合蛋白在大肠杆菌中的表达 |
| 2.2.2.4 原核表达条件的优化 |
| 2.2.2.5 融合蛋白的纯化 |
| 2.2.2.6 Western-blot 检测纯化后的蛋白 |
| 2.2.2.7 多克隆抗体的制备 |
| 2.2.2.8 多克隆抗体的效价及特异性检测 |
| 2.2.3 山羊 ERα和 ERβ重组蛋白多克隆抗体介导的免疫组化方法的建立 |
| 2.2.3.1 常规石蜡切片的制备 |
| 2.2.3.2 HE 法染色 |
| 2.2.3.3 免疫组化方法的建立 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 济宁青山羊和沂蒙黑山羊 ERα和 ERβ全基因的克隆 |
| 3.1.1 组织总 RNA 的制备 |
| 3.1.2 RT-PCR 产物电泳分析 |
| 3.1.2.1 山羊 ERα全基因的克隆 |
| 3.1.2.2 山羊 ERβ全基因的克隆 |
| 3.1.3 ERα和 ERβ基因重组克隆载体的鉴定及序列的测序鉴定 |
| 3.1.3.1 山羊 ERα基因重组克隆载体的鉴定 |
| 3.1.3.2 山羊 ERβ基因重组克隆载体的鉴定 |
| 3.1.4 济宁青山羊和沂蒙黑山羊 ERα和 ERβ基因的同源性分析 |
| 3.1.4.1 ERα基因的同源性分析 |
| 3.1.4.2 ERβ基因的同源性分析 |
| 3.1.5 ERα和 ERβ基因编码氨基酸的主要功能结构域分析 |
| 3.1.5.1 山羊 ERα和 ERβ基因编码氨基酸的主要抗原域预测 |
| 3.1.5.2 济宁青山羊和沂蒙黑山羊 ERα和 ERβ蛋白结构预测与分析 |
| 3.2 山羊 ERα和 ERβ基因的原核表达及多克隆抗体的制备 |
| 3.2.1 重组表达载体的鉴定 |
| 3.2.2 His-ERα和 His-ERβ融合蛋白的表达与纯化 |
| 3.2.2.1 表达菌体的活化 |
| 3.2.2.2 ERα和 ERβ基因在大肠杆菌中的诱导表达 |
| 3.2.2.3 融合蛋白的纯化 |
| 3.2.3 His-ERα和 His-ERβ融合蛋白的 Western blot 分析 |
| 3.2.4 多克隆抗体的效价检测及特异性分析 |
| 3.3 山羊卵巢和子宫中 ERα和 ERβ的定位检测 |
| 3.3.1 山羊卵巢和子宫组织中 ERα定位检测 |
| 3.3.2 山羊卵巢和子宫组织中 ERβ定位检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 山羊雌激素受体基因序列及结构对功能的影响 |
| 4.2 原核表达条件对制备抗体的影响 |
| 4.2.1 原核表达系统表达 ER 基因条件及优势 |
| 4.2.2 原核条件的优化 |
| 4.2.3 包涵体蛋白的纯化与免疫原性鉴定 |
| 4.3 山羊卵巢和子宫组织中 ERα和 ERβ的定位 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 致谢 |
| 作者简介及攻读学位期间发表论文 |
（3）双峰驼繁殖季节生殖轴系中褪黑素受体分布及信号转导（论文提纲范文）
| 缩略词对照表 |
| 中文摘要 |
| Summary |
| 第一篇 文献综述 |
| 参考文献 |
| 第二篇 实验研究 |
| 第一章 繁殖季节雌性双峰驼松果体及生殖轴系中 MR 基因的扩增、测序、分析及定位 |
| 1.材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2.结果 |
| 2.1 总 RNA 的提取 |
| 2.2 RT-PCR 结果 |
| 2.3 克隆质粒的 PCR 鉴定结果 |
| 2.4 克隆质粒的测序分析 |
| 2.5 双峰驼生殖轴系中 MT1和 MT2ｍRNA 表达及定位 |
| 3.讨论 |
| 3.1 MR cDNA 的克隆、测序和分析 |
| 3.2 MR mRNA 表达的定位 |
| 4.小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 松果体及生殖轴系中 MR 的分布 |
| 1.材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 方法 |
| 2.结果 |
| 2.1 松果体中 MR 的表达 |
| 2.2 下丘脑中 MR 的表达 |
| 2.3 垂体中的 MR 的表达 |
| 2.4 卵巢中 MR 的表达 |
| 2.5 双峰驼生殖轴系不同中 MR 分布的差异 |
| 3 讨论 |
| 3.1 关于 MR 在双峰驼松果体及生殖轴系中的定位 |
| 3.2 关于不同组织间 MR 表达的差异性研究 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 MR 信号转导系统 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 信号转导 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 关于细胞培养 |
| 3.2 关于 cAMP 和 cGMP 的测定 |
| 3.3 Mel 对细胞 cAMP 和 cGMP 的影响 |
| 4. 小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 MEL 对 MR MRNA 表达的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 总 RNA 提取及浓度测定 |
| 2.2 目的基因的荧光定量检测 |
| 2.3 MEL 对颗粒细胞 MR MRNA 表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 其受体及 MT1和 MT2mRNA 在卵巢颗粒细胞的表达 |
| 3.2 Mel 对卵巢颗粒细胞 MR mRNA 的调节作用 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
| 导师简介 |
（4）猪Gpr3基因特征、表达及其对卵泡颗粒细胞的影响（论文提纲范文）
| 目录 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语中英文对照（Abbreviaiton). |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 哺乳动物卵子发生与卵泡发育的调控 |
| 1 卵子发生 |
| 1.1 卵子发生过程 |
| 1.2 卵子发生过程中的调控机制 |
| 1.3 卵子发生和卵泡发育的联系 |
| 2 卵泡发育 |
| 2.1 卵泡发育过程 |
| 2.2 卵泡发育的调控 |
| 2.3 颗粒细胞与卵泡发育和闭锁的联系 |
| 参考文献 |
| 第二章 G蛋白偶联受体3的研究进展 |
| 1 G蛋白偶联受体介导的信号通路概述 |
| 2 Gpr3的研究进展 |
| 2.1 Gpr3基因的研究历史 |
| 2.2 Gpr3基因的结构特点 |
| 2.3 Gpr3基因定位及组织分布 |
| 2.4 Gpr3基因的功能 |
| 2.5 Gpr3配体的研究进展 |
| 3 研究的目的和意义 |
| 参考文献 |
| 第二部分 试验研究 |
| 第三章 猪Gpr3基因的克隆鉴定及生物信息学分析 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 PCR扩增猪Gpr3/6/12基因的ORF区 |
| 2.2 RACE和PCR扩增Gpr3的5'UTR、3'UTR和内含子区 |
| 2.3 Gpr3序列拼接及Spidey分析 |
| 2.4 生物信息学分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 Gpr3亚家族基因克隆的策略 |
| 3.2 Gpr3亚家族生物信息学分析 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 猪Gpr3的组织分布与卵母细胞体外成熟过程中的表达规律分析 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 GAPDH检测各组织及细胞总RNA的反转录效果 |
| 2.2 猪Gpr3的组织表达谱分析 |
| 2.3 卵丘细胞扩散评分 |
| 2.4 Gpr3与MPF亚基在卵母细胞体外成熟过程中的表达规律分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 Gpr3在猪卵巢组织中的时空表达规律研究 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 猪卵巢卵泡发育的组织形态学分析 |
| 2.2 猪Gpr3蛋白在不同发育时期卵巢中的表达定位 |
| 2.3 猪Gpr3蛋白在不同发育时期卵泡细胞中的表达变化 |
| 2.4 猪Gpr3 mRNA和蛋白在不同发育时期卵巢中的表达规律分析 |
| 2.5 猪Gpr3 mRNA和蛋白在不同直径卵巢卵泡中的表达规律分析 |
| 2.6 猪Gpr3 mRNA和蛋白在不同品种猪卵巢中的表达规律分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第六章 S1P对猪Gpr3受体组成性活性的影响 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 猪Gpr3重组质粒的鉴定 |
| 2.2 质粒转染HEK293细胞效率的检测 |
| 2.3 质粒转染对猪Gpr3表达的影响 |
| 2.4 猪Gpr3亚细胞定位 |
| 2.5 猪Gpr3组成性活性的鉴定 |
| 2.6 S1P对猪Gpr3组成性活性的影响 |
| 2.7 鞘氨醇和鞘磷脂对猪Gpr3组成性活性的影响 |
| 2.8 S1P对绿色荧光蛋白标记的猪Gpr3受体内化作用的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第七章 阻抑Gpr3信号通路对猪卵泡颗粒细胞生长与分化的影响 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 引物扩增效果检测 |
| 2.2 siRNA转染猪颗粒细胞的效率检测 |
| 2.3 RNAi的方法抑制Gpr3的表达 |
| 2.4 阻抑Gpr3信号通路对颗粒细胞生长的影响 |
| 2.5 阻抑Gpr3信号通路对颗粒细胞周期的影响 |
| 2.6 阻抑Gpr3信号通路对细胞周期相关因子的影响 |
| 2.7 阻抑Gpr3信号通路对颗粒细胞凋亡的影响 |
| 2.8 阻抑Gpr3信号通路对细胞凋亡相关基因表达的影响 |
| 2.9 阻抑Gpr3信号通路对颗粒细胞分泌雌二醇和孕酮的影响 |
| 2.11 阻抑Gpr3信号通路对Gpr3亚家族其它成员mRNA表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第八章 超表达Gpr3对猪卵泡颗粒细胞生长与分化的影响 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 GFP重组载体的鉴定 |
| 2.2 质粒转染颗粒细胞效率的检测 |
| 2.3 质粒转染对Gpr3表达的影响 |
| 2.4 超表达Gpr3对颗粒细胞生长的影响 |
| 2.5 超表达Gpr3对颗粒细胞周期的影响 |
| 2.6 超表达Gpr3对细胞周期相关因子的影响 |
| 2.7 超表达Gpr3对颗粒细胞凋亡的影响 |
| 2.8 超表达Gpr3对细胞凋亡相关基因表达的影响 |
| 2.9 超表达Gpr3对颗粒细胞分泌雌二醇和孕酮的影响 |
| 2.10 超表达Gpr3对类固醇合成相关酶表达的影响 |
| 2.11 超表达Gpr3对Gpr3亚家族其它成员mRNA表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 附录一 主要溶液的配制 |
| 附录二 哺乳动物Gpr3亚家族编码区比对结果 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表及待发表的论文 |
（5）Vasa、卵泡抑素（FST）和抗缪勒氏管激素（AMH）在半滑舌鳎繁殖周期中的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一章 文章综述 |
| 1 Vasa 的研究进展 |
| 2 卵泡抑素的研究进展 |
| 3 抗缪勒氏管激素的研究进展 |
| 4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 半滑舌鳎 Vasa 基因的 cDNA 克隆及其在繁殖周期的表达 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 半滑舌鳎 Vasa 的 cDNA 全长克隆 |
| 2.2 半滑舌鳎 Vasa 的序列分析和系统进化分析 |
| 2.3 半滑舌鳎 Vasa 的组织表达 |
| 2.4 半滑舌鳎 Vasa 在雌鱼繁殖周期中的表达模式 |
| 2.5 半滑舌鳎 Vasa 在雄鱼繁殖周期中的表达模式 |
| 2.6 半滑舌鳎 Vasa mRNA 在卵巢中的原位杂交 |
| 3 讨论 |
| 3.1 半滑舌鳎 Vasa cDNA 克隆和序列分析 |
| 3.2 Vasa mRNA 在半滑舌鳎中的组织分布 |
| 3.3 半滑舌鳎 Vasa 在雌鱼繁殖周期中的表达模式 |
| 3.4 半滑舌鳎 Vasa 在雄鱼繁殖周期中的表达模式 |
| 4 小结 |
| 第三章 半滑舌鳎 FST 基因的 cDNA 克隆及其在繁殖周期的表达 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 半滑舌鳎 FST 的 cDNA 全长克隆 |
| 2.2 半滑舌鳎 FST 的序列分析和系统进化分析 |
| 2.3 半滑舌鳎 FST 的组织表达 |
| 2.4 半滑舌鳎 FST 在雌鱼繁殖周期中的表达模式 |
| 2.5 半滑舌鳎 FST 在雄鱼繁殖周期中的表达模式 |
| 3 讨论 |
| 3.1 半滑舌鳎 FST 的 cDNA 克隆和序列分析 |
| 3.2 FST mRNA 在半滑舌鳎中的组织分布 |
| 3.3 半滑舌鳎 FST 在雌鱼繁殖周期中的表达模式 |
| 3.4 半滑舌鳎 FST 在雄鱼繁殖周期中的表达模式 |
| 4 小结 |
| 第四章 半滑舌鳎 AMH 基因的 cDNA 克隆及其在繁殖周期的表达 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 半滑舌鳎 AMH 的 cDNA 保守片段克隆 |
| 2.2 半滑舌鳎 AMH 的序列分析和系统进化分析 |
| 2.3 半滑舌鳎 AMH 的组织表达 |
| 2.4 半滑舌鳎 AMH 在雌鱼繁殖周期中的表达模式 |
| 2.5 半滑舌鳎 AMH 在雄鱼繁殖周期中的表达模式 |
| 3 讨论 |
| 3.1 半滑舌鳎 AMH 的 cDNA 克隆和序列分析 |
| 3.2 AMH mRNA 在半滑舌鳎中的组织分布 |
| 3.3 半滑舌鳎 AMH 在雌鱼繁殖周期中的表达模式 |
| 3.4 半滑舌鳎 FST 在雄鱼繁殖周期中的表达模式 |
| 4 小结 |
| 总结 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 发表的学术论文 |
（6）抑制素对山羊繁殖力的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词一览表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 抑制素 |
| 1.1 抑制素来源 |
| 1.2 抑制素基因的分子结构 |
| 1.3 抑制素分泌与表达 |
| 1.4 抑制素作用机理 |
| 1.5 抑制素基因的克隆和定位 |
| 1.6 抑制素基因的多态性及其与绵、山羊繁殖力相关性研究 |
| 1.7 抑制素免疫 |
| 1.8 抑制素受体 |
| 2 活化素 |
| 2.1 活化素的来源及结构 |
| 2.2 活化素对生殖的作用 |
| 2.3 活化素受体 |
| 2.4 活化素在动物繁殖中的应用 |
| 3 抑制素和活化素的关系 |
| 4 PCR-SSCP技术 |
| 5 实时荧光定量PCR |
| 5.1 实时荧光定量PCR概述 |
| 5.2 实时荧光定量PCR方法 |
| 5.3 实时荧光定量PCR引物和探针设计要求 |
| 5.4 实时荧光定量PCR在畜牧领域的应用 |
| 6 实验羊只概况 |
| 6.1 南江黄羊 |
| 6.2 大足黑山羊 |
| 6.3 萨能奶山羊 |
| 第二章 引言 |
| 第三章 山羊血浆中INHB、ACTA和FSH含量比较分析 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验羊只的选择与管理 |
| 1.2 实验羊只的处理和样本的采集 |
| 1.3 主要试剂、耗材和仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 血浆中FSH、INHB和ACTA水平的测定 |
| 2.2 统计分析方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 大足黑山羊FSH、ACTA和INHB分泌变化分析 |
| 3.2 南江黄羊FSH、ACTA和INHB分泌变化分析 |
| 3.3 萨能奶山羊FSH、ACTA和INHB分泌变化分析 |
| 3.4 FSH、ACTA和INHB在3个山羊品种(遗传资源)中的比较分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 3个山羊品种(遗传资源)发情周期 |
| 4.2 3个山羊品种(遗传资源)的卵泡期及分泌峰值 |
| 4.3 3个羊种FSH、ACTA和INHB分泌特点分析 |
| 5 小结 |
| 第四章 山羊INHα、INHβA和INHβB亚基基因的克隆及序列分析 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验羊只的来源与样本采集 |
| 1.2 主要试剂和实验耗材 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 主要试剂配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 总RNA提取及检测 |
| 2.2 引物设计 |
| 2.3 cDNA第一链的合成 |
| 2.4 cDNA序列的PCR扩增 |
| 2.5 PCR产物的回收和纯化 |
| 2.6 克隆 |
| 2.7 测序 |
| 2.8 序列分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 卵巢组织总RNA的提取 |
| 3.2 INHα、INHβA和INHβB亚基基因PCR扩增结果 |
| 3.3 山羊INHα、INHβA和INHβB亚基基因cDNA序列分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 山羊组织中的总RNA的提取 |
| 4.2 山羊INHα、INHβA和INHβB序列结构 |
| 4.3 山羊INHα、INHβA和INHβB亚基基因序列多态性 |
| 5 小结 |
| 第五章 山羊INHα、INHβA和INHβB亚基基因多态性分析 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验羊只来源及样本采集 |
| 1.2 主要试剂及耗材 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 主要试剂配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 基因组DNA的提取 |
| 2.2 DNA浓度和纯度的检测 |
| 2.3 引物的设计和合成 |
| 2.4 PCR反应条件和反应体系 |
| 2.5 PCR产物的回收纯化 |
| 2.6 克隆 |
| 2.7 序列测定 |
| 2.8 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 2.9 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 基因组DNA提取结果 |
| 3.2 PCR扩增结果 |
| 3.3 INHα外显子1多态性分析 |
| 3.4 INHα外显子2多态性分析 |
| 3.5 INHβA外显子部分序列多态性分析 |
| 3.6 INHβB外显子1和外显子2多态性分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 PCR反应条件和反应体系的优化 |
| 4.2 PCR-SSCP检测 |
| 4.3 INHα外显子1的多态性 |
| 4.4 INHα外显子2的多态性 |
| 4.5 INHβA外显子部分序列的多态性 |
| 4.6 INHβB外显子1和外显子2的多态性 |
| 5 小结 |
| 第六章 山羊INHα、INHβA和INHβB亚基基因的定量表达 |
| 1 实验材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 INHα亚基基因在组织中的表达 |
| 2.2 INHβA亚基基因在组织中的表达 |
| 2.3 INHβB亚基基因在组织中的表达 |
| 3 讨论 |
| 3.1 不同羊种INHα、INHβA和INHβB亚基基因表达差异分析 |
| 3.2 不同组织INHα、INHβA和INHβB亚基基因表达差异分析 |
| 4 小结 |
| 第七章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的论文、参加课题及获奖 |
（7）罗非鱼卵巢分化和发育相关基因Rspo1、β-catenin和TSP-1的克隆、表达和功能鉴定（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第1章 文献综述 |
| 1 性腺体细胞和生殖细胞的性别分化与发育 |
| 1.1 性腺体细胞的性别分化与发育 |
| 1.2 生殖细胞的性别分化与发育 |
| 2 Wnt/Rspo1/β-catenin信号通路在卵巢分化中的作用 |
| 2.1 卵巢分化过程简述 |
| 2.2 Wnt/β-catenin信号途径的构成 |
| 2.3 Wnt4/β-catenin信号通路在脊椎动物卵巢分化中的作用 |
| 2.4 Rspo1/β-catenin信号通路在脊椎动物卵巢分化中的作用 |
| 3 凝血酶敏感素(TSP)在卵巢发育中的作用 |
| 3.1 凝血酶敏感素家族成员的结构 |
| 3.2 TSP-1在滤泡和卵巢周期性发育过程中的功能 |
| 4 本研究的立项依据和意义 |
| 第2章 罗非鱼Rspo1和两种β-catenin的克隆、序列分析和表达模式研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 药品与试剂 |
| 2.3 罗非鱼Rspo1和两种β-catenin的分子克隆 |
| 2.4 罗非鱼Rspo1、β-catenin的系统发生分析 |
| 2.5 罗非鱼Rspo1和两种β-catenin的组织表达模式研究 |
| 2.6 罗非鱼Rspo1和两种β-catenin的原位杂交分析 |
| 2.7 罗非鱼β-catenin免疫组化研究 |
| 3 结果 |
| 3.1 罗非鱼Rspo1序列和系统发生分析 |
| 3.2 罗非鱼两种β-catenin序列和系统发生分析 |
| 3.3 罗非鱼Rspo1和两种β-catenin组织分布 |
| 3.4 罗非鱼Rspo1和两种β-catenin细胞表达模式 |
| 3.5 罗非鱼β-catenin蛋白表达模式 |
| 4 讨论 |
| 4.1 Rspo1的序列和系统发生分析 |
| 4.2 硬骨鱼类普遍存在两个不同基因编码的β-catenin |
| 4.3 硬骨鱼类存在Rspo1/β-catenin介导的生殖细胞通路 |
| 第3章 罗非鱼β-catenin对Cyp19a1a转录调控作用研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 重组载体的构建 |
| 2.2 细胞培养,转染 |
| 2.3 β-catenin对Cyp19a1a转录调控的荧光素酶报告基因检测 |
| 2.4 数据分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 β-catenin增强Sf1激活的Cyp19a1a启动子的转录活性 |
| 3.2 Fox12和β-catenin-2协同增强Sf1激活的Cyp19a1a启动子活性 |
| 3.3 Dmrt1抑制β-catenin-2增强和Sf1激活的Cyp19a1a启动子活性 |
| 4 讨论 |
| 4.1 罗非鱼β-catenin通过影响雌激素合成参与卵巢分化和发育 |
| 4.2 罗非鱼生殖细胞Rspo1/β-catenin信号通路和体细胞Fox12、Dmrt1信号通路共同调控雌激素的合成 |
| 第4章 TSP-1在罗非鱼性腺分化和发育中作用的研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 罗非鱼两种TSP-1的分子克隆 |
| 2.3 罗非鱼两种TSP-1的序列和系统发生分析 |
| 2.4 罗非鱼两种TSP-1的组织表达模式分析 |
| 2.5 罗非鱼两种TSP-1的细胞表达模式分析 |
| 2.6 罗非鱼两种TSP-1在14-天产卵周期中的表达 |
| 3 结果 |
| 3.1 罗非鱼两种TSP-1序列分析 |
| 3.2 罗非鱼两种TSP-1组织表达模式分析 |
| 3.3 罗非鱼两种TSP-1表达于不同类型的性腺细胞 |
| 3.4 罗非鱼两种TSP-1在产卵周期的表达规律 |
| 4.5 罗非鱼两种TSP-1在其他组织和器官的表达 |
| 4 讨论 |
| 4.1 硬骨鱼类存在两种不同类型TSP-1 |
| 4.2 TSP-1在罗非鱼性别分化和滤泡发生过程中的作用 |
| 4.3 罗非鱼TSP-1影响产卵周期中激素合成 |
| 4.4 罗非鱼TSP-1在骨骼发生中的作用 |
| 附录 促性腺激素在南方鲇卵巢分化和发育中的作用 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料和试剂 |
| 2.2 南方鲇促性腺激素三个亚基cDNA的克隆 |
| 2.3 鱼类促性腺激素序列分析与系统发生树的构建 |
| 2.4 南方鲇促性腺激素三个亚基组织表达和个体发生模式研究 |
| 2.5 药物处理对南方鲇性腺中促性腺激素三个亚基表达水平的影响 |
| 3 结果 |
| 3.1 南方鲇促性腺激素的序列分析 |
| 3.3 南方鲇各组织促性腺激素三个亚基的表达模式 |
| 3.4 药物处理对南方鲇促性腺激素三个亚基表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 南方鲇促性腺激素亚基结构与其他鱼类高度相似 |
| 4.2 促性腺激素也是性腺局部的分泌因子 |
| 4.3 卵巢局部促性腺激素通过参与雌激素的合成影响卵巢分化和发育 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的主要论文 |
| 在读期间参加科研情况 |
（8）蒙古羊BMPR-IB、FSHβ基因克隆与表达及卵巢组织差异表达基因研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 卵泡的发育模式及调控 |
| 1.1.1 卵泡发育的基本模式 |
| 1.1.2 下丘脑-垂体-卵巢轴在卵泡发育过程中的作用 |
| 1.1.3 生长因子对卵泡发育的调控 |
| 1.2 BMPR-IB 基因作为绵羊繁殖性状候选基因的研究进展 |
| 1.2.1 骨形态发生蛋白家族及BMPR-IB 基因的发现 |
| 1.2.2 BMPR-IB 基因的结构及染色体定位 |
| 1.2.3 BMPR-IB 基因对绵羊繁殖性能的影响 |
| 1.3 FSHβ基因的研究进展 |
| 1.3.1 FSHβ基因的结构 |
| 1.3.2 FSHβ基因与动物繁殖性状的关系 |
| 1.4 FSH 与 BMPs 信号传导通路及相互调控机制 |
| 1.5 本研究中所采用主要方法简介 |
| 1.5.1 实时荧光定量 PCR（Real-time Quantitative PCR，RQ-PCR） |
| 1.5.2 抑制性消减杂交技术 |
| 1.5.3 电子克隆技术（Silicon Cloning） |
| 1.6 本研究的目的、意义及主要研究内容 |
| 2 实验一 蒙古羊BMPR-IB 和FSHβ基因的cDNA 克隆与序列分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物及其组织 |
| 2.1.2 菌株和载体 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器和设备 |
| 2.1.5 实验常用溶液和试剂的配制 |
| 2.1.6 主要分子生物学软件及相关网站 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 卵巢组织总RNA 的提取 |
| 2.2.2 RT-PCR 反应过程 |
| 2.2.3 蒙古羊BMPR-IB 和FSHβ基因的克隆与测序 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 蒙古羊卵巢组织总RNA 的提取结果 |
| 2.3.2 蒙古羊BMPR-IB 和FSHβ基因的RT-PCR 扩增结果 |
| 2.3.3 扩增产物的克隆及重组质粒的筛选和鉴定 |
| 2.3.4 蒙古羊BMPR-IB 和FSHβ基因的测序结果及序列拼接 |
| 2.3.5 蒙古羊BMPR-IB 和FSHβ基因序列分析 |
| 2.3.6 蒙古羊BMPR-IB 和FSHβ蛋白结构分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 BMPR-IB 基因对绵羊繁殖性能的调控 |
| 2.4.2 FSHβ基因对绵羊繁殖性能的调控 |
| 2.5 小结 |
| 3 实验二 蒙古羊BMPR-IB 和FSHβ基因在不同组织差异表达研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物及其组织 |
| 3.1.2 主要仪器和设备 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 卵巢组织总RNA 的提取 |
| 3.2.2 RQ-PCR 反应过程 |
| 3.2.3 标准品的制备及标准曲线制作 |
| 3.2.4 差异表达分析方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 蒙古羊各组织总RNA 的提取结果 |
| 3.3.2 蒙古羊β-Actin、BMPR-IB 和FSHβ基因的RQ-PCR 扩增结果分析 |
| 3.3.3 蒙古羊β-Actin、BMPR-IB 和FSHβ基因的RQ-PCR 定量结果分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 关于荧光定量PCR 的引物设计 |
| 3.4.2 关于标准品的制备 |
| 3.4.3 关于相对定量的必要性 |
| 3.4.4 关于定量结果的可信度 |
| 3.4.5 BMPR-IB 和 FSHβ基因的表达与绵羊繁殖性能的关系 |
| 3.5 小结 |
| 4 实验三 单、双羔蒙古羊卵巢组织差异表达基因的筛选及鉴定 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物及其组织 |
| 4.1.2 主要仪器和设备 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 载体和菌株 |
| 4.1.5 实验中所需的引物序列 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 卵巢组织总RNA 的提取 |
| 4.2.2 单、双羔蒙古羊卵巢组织mRNA 的分离与纯化 |
| 4.2.3 抑制性消减杂交过程 |
| 4.2.4 差减文库的构建 |
| 4.2.5 斑点杂交（Dot Blot） |
| 4.2.6 部分差异表达基因的RQ-PCR 验证 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 总RNA 检测及纯化结果 |
| 4.3.2 cDNA 合成与 RsaI 酶切结果 |
| 4.3.3 第二轮PCR 扩增结果 |
| 4.3.4 差减文库的PCR 鉴定结果 |
| 4.3.5 斑点杂交筛选 |
| 4.3.6 差异克隆测序及序列同源性检索 |
| 4.3.7 差异表达基因的功能分析 |
| 4.3.8 部分差异表达基因的RQ-PCR 验证结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 关于差异表达基因的筛选 |
| 4.4.2 部分差异表达基因的功能分析 |
| 4.4.3 关于部分差异表达基因验证结果分析 |
| 4.5 小结 |
| 5 实验四 部分差异表达基因的电子克隆及RT-PCR 验证 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 电子克隆方法 |
| 5.2.2 RT-PCR 实验验证方法 |
| 5.2.3 蒙古羊ADAMT51 和Id3 基因的克隆与测序 |
| 5.2.4 数据分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 电子延伸结果 |
| 5.3.2 RT-PCR 扩增结果 |
| 5.3.3 测序结果及序列分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 关于电子克隆技术 |
| 5.4.2 ADAMT51 基因结构及在排卵中的作用 |
| 5.4.3 Id3 基因结构及生物学功能 |
| 5.5 小结 |
| 6 结论、创新点及进一步研究问题 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 需进一步研究问题 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（9）山羊产羔和牛精液品质与卵泡发育性状主基因鉴定及功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 动物繁殖调控 |
| 1.1 生殖激素调控 |
| 1.1.1 下丘脑-垂体-性腺轴激素 |
| 1.1.2 下丘脑-垂体-性腺轴调节机制 |
| 1.1.3 抑制素在下丘脑-垂体-性腺轴中的反馈调控作用 |
| 1.2 次要生殖激素调控 |
| 1.2.1 GH对性成熟的调控 |
| 1.2.2 GH对卵泡发育和排卵的调控 |
| 1.2.3 GH对卵巢类固醇激素分泌的作用 |
| 1.2.4 GH对子宫的作用 |
| 1.3 细胞因子调控 |
| 1.3.1 主要细胞因子种类及功能 |
| 1.3.2 细胞因子对动物繁殖的调控 |
| 1.4 基因调控 |
| 2 主基因鉴定方法 |
| 2.1 统计分析法 |
| 2.2 基因组扫描法 |
| 2.3 候选基因法 |
| 3 主基因功能研究方法 |
| 3.1 基因转导法 |
| 3.2 基因敲除法 |
| 3.3 基因敲入法 |
| 3.4 RNA干扰方法 |
| 3.4.1 RNA干扰作用机制 |
| 3.4.2 RNA干扰特点 |
| 3.4.3 RNA干扰在动物繁殖相关基因功能研究中的应用 |
| 4 牛羊繁殖性状候选基因研究进展 |
| 4.1 FecB |
| 4.2 FecX |
| 4.3 GH |
| 4.3.1 GH的结构 |
| 4.3.2 GH的功能 |
| 4.3.3 GH与牛羊重要经济性状的关系 |
| 4.4 INHA |
| 4.4.1 INHA与抑制素 |
| 4.4.2 INHA与繁殖性状的关系 |
| 4.5 INHβA |
| 4.5.1 INHβA与抑制素和活化素 |
| 4.5.2 INHβA与繁殖性状的关系 |
| 5 研究目的和意义 |
| 第二章 山羊FecB和FecX基因及其连锁的微卫星座位多态性分析 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验动物与样品采集 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 主要试剂配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 山羊基因组DNA提取及检测 |
| 2.2.2 FecB和FeeX(FecXH、FecXI、FecXG和FecXB)多态性检测 |
| 2.2.3 微卫星座位多态性检测 |
| 2.3 统计分析 |
| 2.3.1 微卫星座位多态性统计分析 |
| 2.3.2 微卫星座位多态性与繁殖性状关联分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 基因组DNA提取质量 |
| 3.2 FecB基因多态性 |
| 3.3 FecX基因多态性 |
| 3.4 与FecB和FecX连锁的微卫星座位多态性 |
| 3.4.1 微卫星座位扩增 |
| 3.4.2 波尔山羊微卫星座位等位基因频率与基因型频率 |
| 3.4.3 波尔山羊微卫星座位遗传多样性 |
| 3.4.4 微卫星座位各基因型产羔数 |
| 4 讨论 |
| 4.1 FecB与FecX基因不是山羊繁殖性状主基因 |
| 4.1.1 FecB在山羊中不存在多态性 |
| 4.1.2 FeeX(FecXI、FecXH、FecXG和FecXB) 在山羊中不存在多态性 |
| 4.2 与FecB和FecX连锁的微卫星座位与山羊繁殖性状有关 |
| 4.2.1 微卫星座位在波尔山羊中的遗传多样性 |
| 4.2.2 微卫星座位对波尔山羊产羔数性状的影响 |
| 4.2.3 BMPR-IB和BMP15基因作为山羊繁殖性状主基因的可能性 |
| 5 小结 |
| 第三章 波尔山羊生长激素基因多态性及对生长和繁殖的调控 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 基因组DNA提取 |
| 2.2.2 GH基因多态性检测 |
| 2.3 统计分析 |
| 2.3.1 GH多态性分析 |
| 2.3.2 GH多态性与繁殖性状关联分析 |
| 2.3.3 GH多态性与生长性状关联分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 GH基因多态性 |
| 3.2 GH基因频率及基因型频率分布 |
| 3.3 波尔山羊公羊GH各基因型早期生长性状 |
| 3.4 波尔山羊母羊GH各基因型早期生长性状 |
| 3.5 波尔山羊母羊GH各基因型产羔数 |
| 4 讨论 |
| 4.1 GH基因部分基因型缺失 |
| 4.2 GH对早期生长性状效应的性别差异 |
| 4.2.1 GH对波尔山羊公羊早期生长性状影响显着 |
| 4.2.2 GH对波尔山羊母羊早期生长性状影响不显着 |
| 4.2.3 GH效应性别差异可能机制 |
| 4.3 GH基因对波尔山羊母羊繁殖性状的影响 |
| 4.4 波尔山羊生长性状与繁殖性状的相互关系 |
| 5 小结 |
| 第四章 山羊抑制素α亚基基因多态性及对产羔数的影响 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 山羊基因组DNA提取 |
| 2.2.2 INHA基因多态性检测 |
| 2.3 统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 INHA基因PCR-SSCP多态性 |
| 3.2 INHA基因SNPs位点 |
| 3.3 INHA基因型频率和基因频率分布 |
| 3.4 山羊INHA各基因型产羔数 |
| 4 讨论 |
| 4.1 INHA是山羊繁殖性状主基因 |
| 4.2 INHA效应在不同品种间存在差异 |
| 4.3 INHA与山羊繁殖性状标记辅助选择 |
| 4.4 候选基因法鉴定主基因功能 |
| 5 小结 |
| 第五章 牛抑制素βA亚基基因多态性及其对精液品质的影响 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 冻精解冻及基因组DNA提取 |
| 2.2.2 INHβA基因多态性检测 |
| 2.3 统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 INHβA基因PCR扩增产物 |
| 3.2 INHβA基因PCR-RFLP多态性 |
| 3.3 INHβA基因型频率和等位基因频率 |
| 3.4 荷斯坦种公牛INHβA各基因型精液品质性状 |
| 4 讨论 |
| 4.1 荷斯坦种公牛INHβA基因多态性影响精液品质 |
| 4.2 INHβA基因是荷斯坦种公牛精液品质性状主基因 |
| 5 小结 |
| 第六章 繁殖性状主基因INHA对牛卵泡细胞发育的作用及作用机制研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 干扰载体 |
| 2.1.3 主要试剂盒 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 牛卵泡颗粒细胞的分离和培养 |
| 2.2.2 INHA基因RNAi重组干扰质粒构建 |
| 2.2.3 重组质粒克隆及纯化 |
| 2.2.4 重组质粒转染牛颗粒细胞 |
| 2.2.5 转染后颗粒细胞总RNA提取及检测 |
| 2.2.6 RT-PCR合成第一链cDNA |
| 2.2.7 颗粒细胞6个基因相对表达量分析 |
| 2.2.8 颗粒细胞细胞凋亡检测 |
| 2.2.9 颗粒细胞细胞周期检测 |
| 2.2.10 颗粒细胞类固醇激素分泌量放免测定 |
| 2.3 统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 INHA基因RNAi重组质粒 |
| 3.2 重组质粒psiRNA转染牛颗粒细胞 |
| 3.3 颗粒细胞总RNA质量 |
| 3.4 RNAi后颗粒细胞6个基因相对表达量 |
| 3.5 RNAi后颗粒细胞凋亡情况 |
| 3.6 RNAi后颗粒细胞细胞周期 |
| 3.7 RNAi后颗粒细胞类固醇激素分泌量 |
| 4 讨论 |
| 4.1 抑制素RNAi效果显着 |
| 4.1.1 影响颗粒细胞6个基因表达量 |
| 4.1.2 抑制颗粒细胞凋亡 |
| 4.1.3 影响颗粒细胞类固醇激素分泌量 |
| 4.2 抑制素促进牛颗粒细胞细胞凋亡的作用及作用机制 |
| 4.2.1 分子调控机制 |
| 4.2.2 细胞因子调控机制 |
| 4.2.3 内分泌调控机制 |
| 4.3 抑制素对卵泡发育的局部调节作用及作用机制 |
| 4.4 抑制素对卵泡闭锁的局部调节作用及作用机制 |
| 4.5 抑制素对发情和排卵的作用及作用机制 |
| 4.6 抑制素对卵巢功能的局部调节作用及作用机制 |
| 4.7 抑制素在动物繁殖领域及人类辅助生殖和卵巢疾病治疗中的应用及应用前景 |
| 4.7.1 抑制素在动物繁殖领域中的应用及应用前景 |
| 4.7.2 抑制素在人类卵巢疾病中的应用及应用前景 |
| 4.7.3 抑制素在人类辅助生殖中的应用及应用前景 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 研究创新点与不足 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ 作者简介 |
| 附录Ⅱ 在读期间发表的学术论着/论文 |
| 附录Ⅲ 在读期间申请的国家发明专利 |
| 附录Ⅳ GeneBank登录基因 |
| 附录Ⅴ 学术交流 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（10）湖羊卵泡颗粒细胞相关差异表达基因的筛选和鉴定及抗氧化物对GSTA1表达的影响（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要缩略词 |
| 第一章 文献综述 |
| 第一节 绵羊卵泡发育机制的研究现状 |
| 1.1 绵羊卵泡发育的基本过程及发育模式 |
| 1.2 卵泡的优势化 |
| 1.3 绵羊卵泡生长发育的调控 |
| 1.4 研究绵羊卵泡发育的意义 |
| 第二节 哺乳动物卵泡发育差异表达基因的研究进展 |
| 2.1 基因差异表达研究方法 |
| 2.2 卵泡发育相关基因差异表达的研究现状 |
| 2.3 哺乳动物EST研究状况 |
| 第三节 颗粒细胞对动物卵泡发育的调控 |
| 3.1 颗粒细胞在卵母细胞成熟和发育过程中的作用 |
| 3.2 卵泡颗粒细胞凋亡与卵泡闭锁 |
| 第四节 主要研究内容及其意义 |
| 4.1 本研究的目的和意义 |
| 4.2 主要研究内容 |
| 第二章 湖羊BMP15和GDF-9受体基因表达的变化及FSH对其表达的影响 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 第三章 湖羊成熟卵泡颗粒细胞差异表达基因的筛选和鉴定 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 第四章 湖羊GSTA1基因的克隆及FSH对其表达的影响 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 第五章 茶多酚对氧化损伤诱导的卵泡颗粒细胞凋亡的影响 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 第六章 提示和创新点 |
| 提示 |
| 创新点 |
| 进一步研究方向 |
| 参考文献 |
| 附录 SSH文库PCR扩增结果 |
| 作者简历及在学期间所取得的科研成果 |
四、人卵巢颗粒细胞雌激素β型受体cDNA的克隆和序列分析（论文参考文献）
- [1]ERK信号通路相关基因在番鸭不同时期卵巢中的作用研究[D]. 汪稳. 福建农林大学, 2017(01)
- [2]济宁青山羊和沂蒙黑山羊ERα和ERβ全基因克隆与多克隆抗体的制备及应用研究[D]. 刘海港. 山东农业大学, 2013(05)
- [3]双峰驼繁殖季节生殖轴系中褪黑素受体分布及信号转导[D]. 胡俊杰. 甘肃农业大学, 2012(11)
- [4]猪Gpr3基因特征、表达及其对卵泡颗粒细胞的影响[D]. 张宝乐. 南京农业大学, 2012(12)
- [5]Vasa、卵泡抑素（FST）和抗缪勒氏管激素（AMH）在半滑舌鳎繁殖周期中的作用研究[D]. 张远青. 中国海洋大学, 2012(03)
- [6]抑制素对山羊繁殖力的影响[D]. 赵中权. 西南大学, 2011(09)
- [7]罗非鱼卵巢分化和发育相关基因Rspo1、β-catenin和TSP-1的克隆、表达和功能鉴定[D]. 吴风瑞. 西南大学, 2010(01)
- [8]蒙古羊BMPR-IB、FSHβ基因克隆与表达及卵巢组织差异表达基因研究[D]. 何小龙. 内蒙古农业大学, 2010(10)
- [9]山羊产羔和牛精液品质与卵泡发育性状主基因鉴定及功能研究[D]. 滑国华. 华中农业大学, 2009(07)
- [10]湖羊卵泡颗粒细胞相关差异表达基因的筛选和鉴定及抗氧化物对GSTA1表达的影响[D]. 陈阿琴. 浙江大学, 2008(04)